Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

L'obiettivo generale del seguente esperimento è isolare i neuroni che trattengono i manganelli sinaptici attaccati e pizzicati che consentono il controllo farmacologico e una migliore presa dello spazio, eliminando l'influenza delle cellule vicine. Ciò si ottiene preparando fette di cervello acute da ratti o topi dal giorno postnatale P 1 al P 21 contenenti l'area cerebrale di interesse per isolare i singoli neuroni come secondo passo. Le fette acute vengono poste in un piatto e una micropipetta di vetro sigillata a fiamma viene fatta vibrare all'interno dell'area di interesse mentre si muove la punta attraverso la fetta, liberando i singoli neuroni.

Ai neuroni viene concesso il tempo di attaccarsi al fondo del piatto. Successivamente, la capsula contenente neuroni fibro dissociati viene spostata su un microscopio per esaminare la fisiologia sinaptica, la farmacologia, la modulazione, la plasticità, nonché l'imaging in tempo reale e la caratterizzazione degli elementi pre e post-sinaptici nella cellula vivente si ottengono risultati che mostrano le caratteristiche fisiologiche e farmacologiche delle risposte sinaptiche e i cambiamenti associati nella funzione terminale presinaptica attraverso una chiusura ermetica, Registrazione di cellule intere e microscopia a fluorescenza. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la registrazione da fette di cervello, neuroni coltivati e neuroni enzimaticamente dissociati, è che il bns sinaptico attaccato al pizzico consente il controllo e la visualizzazione degli elementi presinaptici, mentre la struttura postsinaptica relativamente compatta consente un migliore voltage clamp e un eccezionale controllo dell'ambiente extracellulare.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la resa per ottenere neuro sani può variare notevolmente a seconda di diverse condizioni, come l'età dell'animale, i parametri di vibrazione e l'area di interesse nella fetta. Inoltre, le registrazioni cellulari persistono per meno tempo rispetto ai vetrini convenzionali. Registrazioni. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di dissociazione VI sono difficili da apprendere perché è difficile descrivere con precisione la distanza di movimento e il dissenso attraverso la fetta I Per prepararsi a fare le fette di cervello, preparare la bolla di liquido cerebrospinale artificiale A CSF con carbogen per 15 minuti.

Quindi, aggiungi due millimolari di cloruro di calcio e un millimolare di cloruro di magnesio. Dopo aver anestetizzato e decapitato un animale di età compresa tra uno e 21 anni dopo la nascita, rimuovere il cervello, quindi tagliarlo nell'orientamento desiderato in modo da includere la regione di interesse. Fissare il cervello sezionato a uno stadio e immergerlo in una camera riempita con A CSF.

Quindi montare la camera su un'affettatrice cerebrale e sezionare il cervello a uno spessore compreso tra 250 e 400 micrometri per fetta con una lama vibrante. Mettere le fette di un liquido cerebrospinale e farle bollire con carbogeno in una camera di pre-incubazione per almeno un'ora. Per preparare una micropipetta in vetro sigillata a fiamma, tirare prima una micro pipetta patch clamp standard con un diametro della punta di due micrometri su un estrattore per micropipette marrone fiammante o equivalente.

Posizionare la punta della micropipetta nella fiamma di un bruciatore bunsen per circa due secondi per formare una sfera fusa di 200-300 micrometri di diametro. Successivamente, posizionare la pipetta patch sigillata a fiamma su un supporto del micromanipolatore che può essere rapidamente fatto vibrare da un lato all'altro con una distanza di corsa da 100 a 200 micrometri utilizzando un relè bimorfo elettrico piso o un dispositivo di efficacia equivalente. Preparare cumuli di soluzione salina tamponata.

Regolare la soluzione con idrossido di sodio a pH 7,4 e l'osmolarità con saccarosio a circa 300 milli osmoli. Quindi riempire una piastra di coltura di 35 millimetri di diametro con cumuli di soluzione salina tamponata. Posizionare una fetta nel piatto di coltura, visualizzarla con uno stereoscopio da dissezione a 250 x di ingrandimento con un filo piegato.

Tenere la fetta sul fondo del piatto per dissociare le cellule. Posizionare la punta della micropipetta sigillata a fiamma sulla superficie della fetta. Attivare il micromanipolatore in modo che la punta vibri lateralmente da 10 a 30 hertz con una distanza di escursione di circa 100 micrometri.

Abbassare la punta della micropipetta nella fetta con il manipolatore microm in modo che tagli l'intera profondità entro 30 secondi. Ripetere questo passaggio secondo necessità per massimizzare il numero di neuroni isolati. Quindi, rimuovere la punta dalla fetta.

Raccogli la fetta con una pinza e agitala delicatamente nella soluzione. Quindi rimuovere completamente la fetta dalla soluzione. Lasciare che le cellule si depositino sul fondo del piatto per almeno 10 minuti.

Posiziona il piatto contenente i neuroni sul tavolino di un microscopio invertito e visualizzali con un obiettivo da uno x a 63x. Cerca i neuroni che hanno membrane lisce senza blaterare e nuclei rilevabili, ma non sovradimensionati. Se si utilizza un'ottica a contrasto di fase, cercare i neuroni luminosi di fase con una sfumatura giallastra, ma non troppo blu.

Estrarre una micropipetta patch standard utilizzando un estrattore marrone fiammante o equivalente con la resistenza del puntale della pipetta da due a quattro mega ohm. Riempire la pipetta del cerotto con una soluzione intracellulare a base di cloruro di cesio per la misurazione delle risposte sinaptiche o con una soluzione intracellulare a base di cloruro di potassio per la misurazione delle proprietà intrinseche della membrana e dei potenziali d'azione. Eseguire il patch clamp dell'intera cellula sul neurone utilizzando tecniche elettrofisiologiche standard.

Prima registrazione di correnti post-sinaptiche spontanee utilizzando un protocollo di acquisizione dati privo di gap. Successivamente, applicare 200 nan di tossina animale o tetro e/o soluzione extracellulare a basso contenuto di calcio per registrare correnti post-sinaptiche in miniatura per modificare il contenuto molecolare extracellulare. I farmaci di interesse vengono caricati singolarmente in uno dei barili di un tubo di vetro fuso a punta quadrata, posizionato vicino al neurone di interesse.

Un singolo cilindro è esposto al neurone da un micro manipolatore azionato da un motore passo-passo che si muove lateralmente per consentire lo scambio di soluzione da 10 a 100 millisecondi. Guarda il bns scaricato ad alto ingrandimento con un obiettivo ad alta apertura numerica in un microscopio basato su fotocamera o multifotone. Qui è mostrata l'immagine di un neurone e di bns catturati con una fotocamera per dispositivi ad accoppiamento di carica moltiplicatrice di elettroni.

La potenza della sorgente luminosa per l'eccitazione è stata attenuata all'1,2% con un filtro a densità neutra 1,0 e un filtro a iride regolato al 12% di uscita durante le registrazioni con morsetto di tensione. Con una soluzione intracellulare a base di cloruro di cesio, si osservano correnti sinaptiche spontanee per visualizzare la fusione vescicale. Nei manganelli presinaptici, abbiamo utilizzato topi che esprimono il costrutto sinaptico del fiorino sotto il controllo del promotore TH one.

La fiorina sinaptica è un costrutto molecolare in cui il fiorino eclittico, un mutante GFP con una maggiore sensibilità al pH, è legato alla proteina di membrana associata vescicale dopo la fusione vescicale. Questo motivo è esposto all'ambiente extracellulare più neutro con un conseguente aumento della fluorescenza ai punti che corrispondono alle vescicole e ai terminali presinaptici. La dissociazione fibrologica dei neuroni ippocampali da questi topi consente la visualizzazione di punti fluorescenti delle dimensioni e della posizione previste per i terminali GABAergici durante il tentativo di questa procedura.

È importante ricordare che per avere neuroni sani, è necessario assicurarsi di avere fette sane. Pertanto, la preparazione di fette cerebrali acute è un passo importante in questa procedura Dopo questa procedura. Altri metodi, come l'immunoistochimica o la RT PCR R a cellula singola, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quali proteine e specie di mRNA sono espresse nei manganelli sinaptici o nei neuroni postsinaptici.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere neuroni isolati sani e usarli per l'elettrofisiologia e l'imaging in tempo reale.