Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali olfattive nasali da ratti o esseri umani al fine di identificare anomalie molecolari o riparare il cervello patologico o traumatizzato. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando chirurgicamente biopsie della mucosa olfattiva dalla cavità nasale. Successivamente, si elimina l'epitelio olfattivo e le sue cellule staminali epiteliali per concentrarsi sulle cellule staminali ecto-mesenchimali presenti nella lamina propria sottostante, quindi si isolano tali cellule dissociano il tessuto del roditore o raccogliendo le cellule in uscita da impianti umani coltivati sotto coprioggetti di vetro.

L'ultimo passaggio della procedura consiste nel coltivare sferoidi di cellule staminali inducendo la differenziazione in cellule simili a neuroni. In definitiva, da un espianto dell'intera mucosa olfattiva si ottengono cellule staminali singole. Sferoidi in sospensione o cellule simili a neuroni possono essere utilizzati per identificare marcatori molecolari nelle malattie cerebrali o per riparare i danni al sistema nervoso.

Descriviamo il suo metodo per isolare cellule staminali nasali umane e di roditore dalla mucosa olfattiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le cellule staminali appartengono a un tessuto nervoso, sono facilmente accessibili in ogni individuo vivente e possono essere utilizzate per diagnosticare o riparare il cervello affetto da patologie. Come chirurgo otorinolaringoiatra, ho eseguito centinaia di biopsie nasali per divertimento in studi clinici.

La procedura è sicura e può essere eseguita. E l'anestesia generale locale. Sono uno scienziato junior con competenze nella coltura di cellule staminali umane o di roditore, nasali o fattoriali.

Queste presentano un'elevata velocità di preparazione e una tendenza a differenziarsi in tipi cellulari neuronali. Si sono dimostrate efficaci in modelli animali di amnesia e di malattia neurodegenerativa. Prima del prelievo delle biopsie di mucosa, si utilizzano piastre Petri da 35 mm contenenti mezzo di coltura DMEM/Ham F12, preparato in una cappa a flusso laminare sterile.

Ora, dopo aver verificato mediante la compressione delle dita dei piedi che il ratto è entrato in anestesia profonda con pentobarbital sodico, praticare l'eutanasia mediante decapitazione. Isolare la testa e rimuovere la pelle. Rimuovere la mandibola inferiore con le forbici e, con l'aiuto del proprio giurato, eliminare i muscoli facciali su entrambi i lati a partire dalla parte posteriore degli incisivi.

Utilizzando il Ron Jur, rimuovere l'osso che ricopre la cavità nasale un lato alla volta. I turbinati olfattivi appaiono come organi di colore arancione o marrone situati nella parte posteriore del naso; rimuovere delicatamente i turbinati con la pinzetta.

Utilizzando un ago da 26 gauge, isolare la mucosa olfattiva che si trova sul setto tagliando il tessuto lungo tre linee: l'arco della lamina perpendicolare, la lamina del CRI e il tetto della cavità nasale. Raccogliere biopsie da entrambi i lati e trasferirle in una piastra di Petri riempita con A-D-M-E-M ham F 12. Questa procedura non deve richiedere più di 10 minuti a partire dall'inizio dell'eutanasia.

Ora, per rimuovere il muco, trasferire i prelievi due volte in piatti di Petri contenenti mezzo, in conformità con i pertinenti comitati etici locali. Questa procedura deve essere eseguita da un chirurgo otorinolaringoiatra e ogni paziente ambulatoriale deve firmare un modulo di consenso informato, utilizzando un endoscopio rigido a zero gradi o a 30 gradi. Ispezionare entrambe le cavità nasali e valutare la presenza presunta di polipi o di qualsiasi lesione infiammatoria.

Scegliere la migliore cavità nasale tenendo conto della deviazione del setto. Applicare con un applicatore di cotone un anestetico locale, come la lidocaina con epinefrina, per 10 minuti effettuando un taglio trasversale. Con pinze etmoidali prelevare un campione bioptico di due millimetri quadrati alla radice dell'aspetto mediale del turbinato medio oppure sul setto nella regione mediale dorsale.

Qui mostriamo il campione prelevato dalla zona radicolare. Il campione olfattivo viene quindi trasferito, mediante un ago sterile, in un tubo sterile da due millilitri contenente un millilitro di DMEM/F12. Capovolgere il tubo delicatamente per assicurarsi che il campione sia completamente immerso nel mezzo di coltura.

Inserire il tubo in un contenitore refrigerato e trasportarlo al laboratorio di ricerca. A questo stadio, la biopsia può essere utilizzata direttamente per studi molecolari comparativi focalizzati su specifiche malattie cerebrali oppure processata per generare cellule staminali. Lavare le biopsie umane o di ratto e incubare le biopsie in una piastra di Petri riempita con un millilitro di dis paste in DMEM ham F 12.

Due soluzioni per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, l'epitelio olfattivo umano o di ratto viene rimosso dalla lamina propria sottostante utilizzando una spatola microchirurgica al microscopio stereoscopico con luce trasmessa deviata. L'epitelio olfattivo appare traslucido su sfondo nero, a differenza della lamina propria, che presenta striature arancio-brune su sfondo bianco.

L'epitelio appare grigio e la lamina propria marrone una volta purificata; trasferire la lamina propria in una piastra di Petri contenente DMEM/F12. Se il tessuto proviene da un roditore, tagliare la lamina propria in piccoli pezzi utilizzando due aghi da 25 gauge. Successivamente, trasferire i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente un millilitro di collagenasi tipo I A nel tubo, usando una pipetta di plastica sterile per dissociare il tessuto.

Quindi incubare il tubo per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per interrompere la dissociazione, agitare delicatamente il tubo e aggiungere millilitri di PBS privo di calcio e magnesio e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Ripesare, sospendere il pellet cellulare nel mezzo di coltura e coltivare su piatti di plastica.

Ora, se il tessuto è umano, tagliare il limone in modo appropriato in tre o quattro pezzi. Inserire ogni striscia in un proprio pozzetto di due centimetri di diametro in una piastra a quattro pozzetti e coprire il tessuto con coprioggetti di vetro sterili di 1,3 centimetri di diametro.

Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura in ogni piastra di coltura per entrambi i tipi di tessuto. Rinnovare il mezzo di coltura ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni di coltura, le cellule staminali inizieranno a invadere la piastra di coltura.

Dopo due settimane, le cellule dovrebbero essere confluenti. Quando si raggiunge la confluenza, effettuare il passaggio e trasferire le cellule in fiaschi di coltura per generare sferoidi di cellule staminali.

Ripiantare le cellule a una densità di 16.000 cellule per centimetro quadrato in flaconi pretrattati ogni due giorni. Nutrire le cellule con 0,2 millilitri per centimetro quadrato di mezzo integrato. Due-cinque giorni dopo, raccogliere le sferoidi cellulari in sospensione e riutilizzarle o dissociazione prima del trapianto.

Un modello animale di terapia cellulare per differenziare le cellule staminali olfattive in cellule simili a neuroni. Coltivare le cellule per 21 giorni in mezzo neurobasale contenente B27, penicillina, streptomicina, glutammina e glutammato, quindi effettuare il cambio del mezzo ogni tre giorni. Le cellule simili a neuroni dovrebbero apparire dopo due o tre settimane, da cinque a sette giorni dopo la semina.

Le cellule staminali olfattive umane nasali sono cresciute dall'espianto e si sono proliferate rapidamente. La confluenza poteva essere raggiunta entro una o due settimane. Una caratteristica fondamentale delle cellule staminali, la formazione di nidi e l'espressione, è stata valutata quando le cellule sono state coltivate su polilisina con un mezzo di coltura privo di siero, integrato con EGF e FGF2; le cellule staminali olfattive hanno generato sfere quando queste ultime sono state seminate in un mezzo di coltura contenente siero.

Mezzo, hanno dato origine a popolazioni cellulari contenenti circa il 50% di cellule esprimenti GFAP, fino al 15% di cellule esprimenti tubulina e fino al 5% di cellule esprimenti oh quattro. Quando le cellule derivate da sferoidi sono state coltivate in mezzo di coltura neurobasale supplementato, la maggior parte della popolazione è diventata cellule simili a neuroni che esprimevano beta tre tubulina. Le stesse cellule simili a neuroni esprimevano anche map due.

Pertanto, il destino delle cellule staminali potrebbe essere modificato in un semestre. Questa tecnica può generare facilmente milioni di cellule staminali in meno di quattro settimane, consentendo ai clinici di eseguire futuri trapianti cellulari autologhi. Le biopsie refrattarie nasali sono molto utili per identificare biomarcatori e malattie cerebrali.

Recentemente siamo riusciti a identificare nuovi geni candidati per l'autismo. Abbiamo già allestito una biobanca di cellule staminali olfattive provenienti da individui autistici e da controlli, che può essere estesa ad altre patologie cerebrali umane.