Name: Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Impara a isolare cellule staminali olfattive nasali da ratti e umani per studiare anomalie molecolari nelle malattie cerebrali. Questa tecnica sicura permette di ottenere cellule multipotenti per trapianti autologhi.

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Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dalla ANR (Agence Nationale de la Recherche), AFM (Association Française contre les Myopathies), FESR in PACA e Irme (Institut de Recherche sur la Moelle épinière et l&#39;Encéphale). Si ringrazia Marie Pierre Blanchard (Jean Roche Institute) per il suo aiuto efficiente durante la registrazione temporizzata.

1. Raccolta di mucosa olfattiva in topi <ol><li> Iniziate preparando tre piatti 35 millimetri Petri riempite con DMEM / HAM F12 terreno di coltura in una cappa di cultura pulito. </li><li> Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere approvato preventivamente dalla cura degli animali dell'istituto e sul comitato per l'uso e svolte da personale qualificato. Dopo che il ratto è entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme di anestesia iniettabili come la chetamina / xylazina, decapitare e togliere la pelle. Anestetici inalatori dovrebbero essere evitati. L'adeguatezza di anestesia sarà valutata pizzico piedi prima di decapitazione. Rimuovere la mascella inferiore con le forbici e con l'aiuto di una pinza ossivora, eliminare i muscoli facciali su entrambi i lati. </li><li> A partire dalla parte posteriore degli incisivi, rimuovere con una pinza ossivora l'osso che copre la cavità nasale, da un lato alla volta. I turbinati olfattivo entrare in vista come arancio / marrone organi che si trovano nella parte posteriore del naso. </li><li> Delicatamente scartare il turbinati con una pinza. Utilizzando un ago 26 gauge, isolare la mucosa olfattiva sdraiato sul setto tagliando il tessuto lungo tre direttrici: l'arco della piastra perpendicolare, la lamina cribrosa e il soffitto della cavità nasale. </li><li> Raccogliere biopsie su entrambi i lati e trasferirli in un DMEM / HAM F12 piena di Petri. Questa procedura non dovrebbe richiedere più di 10 minuti dalla comparsa eutanasia. </li><li> Ora, al fine di rimuovere il muco, trasferire le biopsie due volte in media riempito piastre di Petri. </li></ol> 2. Raccolta di mucosa olfattiva negli esseri umani <ol><li> Questa procedura deve essere effettuata da un Otorinolaringoiatria (ORL), chirurgo, in conformità con le pertinenti locale comitato etico (s), e ogni ambulatoriale deve firmare un modulo di consenso informato. </li><li> Usando una 0 ° o 30 ° endoscopio rigido (4 mm di diametro), ispezionare sia cavità nasali e valutare la presenza putativo di polipi o lesioni infiammatorie. Scegli il miglior cavità nasale, tenendo conto della deviazione del setto. </li><li> Usando un applicatore di cotone, applicare un anestetico locale, come la lidocaina con adrenalina, per 10 minuti. </li><li> Con una pinza throughcut etmoide, raccogliere a due millimetri quadrati biopsia sia alla radice del mediale del turbinato medio o sul setto nella zona dorsomediale. </li><li> La biopsia olfattivo viene trasferito, utilizzando un ago sterile, in una sterile 2 ml di tubo riempito con 1 ml di DMEM / HAM F12. Punta il tubo a testa in giù per assicurarsi che la biopsia è immerso nel mezzo di coltura. </li><li> Inserire il tubo in un contenitore refrigerato e il trasporto al laboratorio di ricerca. In questa fase, la biopsia può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare focalizzata sulle malattie cerebrali specifici o trattati per la generazione di cellule staminali. </li></ol> 3. Isolamento di cellule staminali da olfattivi dell'uomo e Rat Mucosa <ol><li> Lavare le biopsie in DMEM / HAM F12. Incubare le biopsie in piastre di Petri riempite con 1 ml di soluzione dispasi II (2,4 UI / ml), per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Poi, sotto un microscopio da dissezione con una luce diffratta invertito, l'epitelio olfattivo viene rimosso dal lamina propria sottostante con una spatola micro. </li><li> L'epitelio olfattivo è più sottile e sembra trasparente su uno sfondo nero rispetto alla lamina propria, che è a strisce arancio / marrone. Su uno sfondo bianco, l'epitelio appare grigia e la lamina propria, marrone. </li><li> Una volta purificate, trasferire la lamina propria in una capsula di Petri riempite con DMEM / HAM F12. </li><li> Se il tessuto è di un roditore, quindi tagliare la lamina propria in piccoli pezzi con due aghi di calibro 25. Poi, il trasferimento dei pezzi ad un tubo da 15 ml riempita con 1 ml di collagenasi IA. </li><li> Nel tubo, usando una pipetta sterile in plastica, dissociare il tessuto. Poi, incubare la provetta per 10 minuti a 37 ° C. </li><li> Per terminare la dissociazione, agitare delicatamente il tubo e aggiungere 9 ml di Ca-Mg libero e senza PBS e centrifugare a 200 g per 5 minuti. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in DMEM / HAM F12 mezzo di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino, antibiotici e piastra su piatti di plastica cultura. </li><li> Ora, se il tessuto è umano, allora fetta della lamina propria in 3 a 4 pezzi con uno spessore da 200 a 500 micron. </li><li> Inserire ogni striscia il meglio di sé 2 piatto cultura cm di diametro e coprire con il tessuto sterile 1,3 scivola in vetro diametro cm copertura. </li><li> Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura (DMEM / HAM F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici) per ogni piatto cultura. </li><li> Per entrambi i tipi di tessuto, rinnovare il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Cinque a sette giorni dopo, le cellule staminali cominciano a invadere il piatto cultura e dopo due settimane dovrebbero essere confluenti. Quando confluenza viene raggiunto, passaggio e trasferimento alle cellule di fiaschi cultura. </li></ol> 4. Sfera Formazione e differe neuronalentiation delle cellule staminali olfattive <ol><li> Per generare sfere di cellule staminali, incubare i palloni per due ore a 37 ° C con poli-L-lisina. (TESTO: 5 g/cm2). </li><li> Piastra le cellule ad una densità di 16.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi trattati. </li><li> Ogni due giorni, nutrire le cellule con 0,2 ml per centimetro quadrato di media integrati (DMEM / HAM F12 integrato con l'insulina, transferrina, selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml)). </li><li> Da due a cinque giorni dopo, raccogliere le sfere delle cellule galleggianti e realizzato una nuova targa o dissociare prima innesto in modelli animali di terapia cellulare. </li><li> Per differenziare le cellule staminali in neuroni olfattivi-come le cellule, li coltivano per 21 giorni in media Neurobasal contenente B-27, penicillina, streptomicina, glutammina e glutammato. </li><li> Quindi apportare le modifiche di media ogni 3 giorni. Neurone-come le cellule dovrebbero apparire dopo due o tre settimane. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Nasale umano espianto-superando le cellule staminali (Figura 2A) si dividono rapidamente e confluenza può essere raggiunto in una o due settimane. Una caratteristica chiave di staminalità, espressione nestina, è stata valutata (Figura 2B). Quando coltivate su poli-L-lisina con un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml), le cellule staminali olfattive dar luogo a sfere (figura 2C). Quando coltivate in siero contenente terreno di coltura di nuova sfere placcati dare origine a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) 9 (Figure 2D-F). Tuttavia, il destino della sfera cellule derivate possono essere modificati. Per esempio, quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e il glutammato, la maggior parte delle cellule staminali olfattive nasale in neurone-come le cellule che esprimono β-tubulina III (Figura 2G) e MAP2 (Fig. 2H). <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schema generale dell'esperimento. Biopsie della mucosa olfattiva sono asportati dal ratto o umano cavità nasale. Espianti può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare al fine di individuare biomarcatori in malattie del cervello. Per isolare le cellule staminali olfattive, le interazioni tra la lamina propria e il neuro-epitelio sono interrotti con la II dispasi enzima e, dopo 45 minuti, l'epitelio viene rimosso con un micro-spatola. Le cellule staminali olfattive roditori vengono ulteriormente selezionati dalla dissociazione della lamina propria con collagenasi IA. Per i tessuti umani, pezzi di lamina propria olfattive sono coltivate sotto vetro coprioggetto fino cellule staminali superando invadere l'intero bene. Dopo la proliferazione, utilizzando un mezzo appropriato coltura, le cellule staminali olfattive possono generare sfere o differenziarsi in neuroni-come le cellule. Le cellule staminali olfattive possono essere usati per i) patologie cerebrali riparazione o trauma o ii) identificare marcatori molecolari di malattie del sistema nervoso centrale. Le illustrazioni sono realizzate con l'ausilio di Arte Servier medica. <img src="/files/ftp_upload/2762/2762fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cultura e la differenziazione delle cellule staminali nasali olfattive. Cellule staminali umane a crescere senza la lamina propria a espianto (A) dividono rapidamente, quando coltivate in un siero contenente mezzo. Le cellule staminali esprimono la staminalità marcatore nestina (B). Quando placcato in poli-L-lisina rivestite di plastica e coltivati ​​in un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF e FGF2, le cellule staminali olfattive generare sfere (C). Sfera cellule derivate, quando placcato in siero contenente terreno di coltura, danno luogo a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) 9 (DF). Quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e glutammato, essi si differenziano in neuroni-come le cellule che esprimono β-tubulina III (G) e MAP2 (H).

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<li>Mackay-Sim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+olfactory+ensheathing+cell+transplantation+in+human+paraplegia%3A+a+3-year+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Autologous olfactory ensheathing cell transplantation in human paraplegia: a 3-year clinical trial.</a> Brain. 131, 2376-2386 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Le tecniche qui presentate fanno il roditore e umano mucosa olfattiva un modello utile per la ricerca clinica sulle cause di malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative, nonché uno strumento per riparare il cervello patologica o traumatizzati. Il protocollo è relativamente semplice e può essere facilmente effettuata da un esperto biologo cellulare. Il tasso di successo per le tecniche di biopsia e la cultura è alto. Passaggi critici <ul><li> Per la raccolta di roditore mucosa olfattiva, si consiglia di non superare un limite di tempo di 10 minuti tra l&#39;eutanasia e l&#39;escissione finale del tessuto olfattivo. </li><li> La dissociazione della lamina propria a olfattivo dei roditori si raggiunge solitamente dopo 10 min. incubazione in collagenasi IA. In caso contrario, si consiglia di raccogliere il giorno dopo il supernatante in cui i bit non dissociato del galleggiante lamina propria, si centrifugare a 200 g e meccanicamente dissociare la lamina mobile usando una pipetta Pasteur prima replating le cellule in un nuovo bene. Il primo pozzo che contiene le cellule già fissato è piena di terreno di coltura fresco. </li><li> Per la lamina propria umano, che è più compatto rispetto al tessuto roditore, si sconsiglia di uno dissociazione enzimatica. Il tessuto viene tagliato e ogni espianto è inserita tra il fondo del piatto di plastica e un copri bicchiere. Culture di successo sono espianti il ​​cui spessore va da 200 a 500 micron. </li></ul> Eventuali modifiche <ul><li> Il protocollo attuale può essere leggermente modificata in modo da generare neuroni olfattivi in ​​vitro. A tal fine, il neuro-epitelio non viene rimosso e la mucosa olfattiva è tutta a fette con un chopper McIlwain (200 micron di spessore). Ogni espianto è placcato in un piatto, parzialmente essiccato per un&#39;ora e poi reidratato con FCS contenenti terreno di coltura. Durante il primo messaggio placcatura giorni, le cellule epiteliali e mesenchimali crescere fuori l&#39;espianto. Poi, progenitori dei neuroni migrerà sulla parte superiore di questo strato di cellule e differenziarsi in neuroni. </li><li> Purificazione di cellule staminali olfattive possono essere raggiunti in citometria a flusso. Specifici marcatori di superficie possono essere recuperate dalla lista pubblicata sul giornale di caratterizzazione 11. </li><li> Per gli esperimenti di trapianto, è possibile utilizzare un ceppo di topi le cui cellule staminali olfattive sono GFP-positive. Questo ceppo ratto (Sprague Dawley, eGFP guidato dal promotore PGK) sono disponibili all&#39;indirizzo ITERT (Nantes, Francia). Per l&#39;inserimento del gene GFP in cellule staminali olfattive, usiamo un metodo basato sulla infezione lentivirus. </li><li> Questo documento si concentra su olfattivo ecto-le cellule staminali mesenchimali. Tuttavia, un altro tipo di cellula di interesse, le cellule olfattive ensheathing, può essere purificati dal tessuto stesso. Abbiamo descritto un metodo per la loro raccolta e la depurazione 1,17 e abbiamo usato cellule nasali ensheathing per uno studio di fase I / IIa clinica in pazienti paraplegici 18. </li><li> In qualità di membro della superfamiglia delle cellule staminali mesenchimali, OE-MSC sono in grado, in appropriate condizioni di coltura, di differenziarsi in adipociti, osteociti e miociti 11. </li></ul> Applicazioni future <ul><li> Abbiamo già usato biopsie olfattivo umano per studiare le anomalie cellulari e molecolari in pazienti affetti da autismo, disturbo bipolare, disautonomia familiare, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer e la schizofrenia 2-7. Teoricamente, tutte le malattie del cervello possono essere studiate usando biopsie nasali o periferico delle cellule staminali olfattive. </li><li> Roditore e cellule staminali olfattive nasali sono già stati innestati in modelli animali di amnesia, morbo di Parkinson, danni cocleari e traumi del midollo spinale 12-16. E &#39;concepibile di trapiantare queste cellule in modelli animali della malattia di Alzheimer, l&#39;ischemia cerebrale, sclerosi multipla. </li></ul>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td colspan="3"> Raccolta della mucosa olfattiva nei ratti </td></tr><tr><td> DMEM / PROSCIUTTO F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 31331-028 </td></tr><tr><td> Sodio pentobarbital </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pinza ossivora </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> 26 gauge </td><td> Terumo </td><td> NN-2613R </td></tr><tr><td> Forcipe </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Raccolta della mucosa olfattiva nell&#39;uomo </td></tr><tr><td> Endoscopio rigido </td><td> Karl Storz Medical o Richard Wolf </td><td></td></tr><tr><td> Lidocaina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Epinefrina </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Throughcut etmoide forcipe </td><td> Karl Storz Medical o Richard Wolf </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> Isolamento di cellule staminali olfattive </td></tr><tr><td> Dispasi II </td><td> Roche </td><td> 10 295 825 001 </td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Spatola Micro </td><td> FST </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi IA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C9891 </td></tr><tr><td> Ca-free/Mg-free PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td></tr><tr><td> Siero di vitello fetale </td><td> Invitrogen </td><td> 10270098 </td></tr><tr><td> Vetro coprioggetto </td><td> Knittel Glaser </td><td> 001/35 </td></tr><tr><td colspan="3"> Sfera formazione e la differenziazione neuronale </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-1274 </td></tr><tr><td> Insulina transferrina selenio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 51500056 </td></tr><tr><td> FEG </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 236-EG </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 233-FB </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B-27 senza siero Supplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td></tr><tr><td> Glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030024 </td></tr><tr><td> Glutammato </td><td> Sigma-Aldrich </td><td></td></tr></tbody></table>

isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o umani

Isolating Nasal Olfactory Stem Cells from Rodents or Humans

La mucosa olfattiva, che si trova nella cavità nasale, si occupa di rilevare gli odori. E &#39;anche l&#39;unico tessuto nervoso che è esposta all&#39;ambiente esterno e facilmente accessibile in ogni individuo vivente. Come risultato, questo tessuto è unico per chiunque al fine di individuare le anomalie molecolari nel cervello patologico o di isolare le cellule staminali adulte per la terapia cellulare. Anomalie molecolari nelle malattie del cervello sono spesso studiati utilizzando campioni di tessuto nervoso raccolti post-mortem. Tuttavia, questo materiale ha numerose limitazioni. Al contrario, la mucosa olfattiva è facilmente accessibile e può essere sottoposte a biopsia in modo sicuro senza alcuna perdita di olfatto 1. Di conseguenza, la mucosa olfattiva fornisce una &quot;finestra aperta&quot; nell&#39;essere umano adulto attraverso il quale si può studiare di sviluppo (es. autismo, schizofrenia) 2-4 o neurodegenerative (ad esempio, Parkinson, Alzheimer), le malattie 4,5. Mucosa olfattiva possono essere utilizzati sia per studi comparativi molecolari 4,6 o esperimenti in vitro sulla neurogenesi 3,7. L&#39;epitelio olfattivo è anche un tessuto nervoso che produce ogni giorno nuovi neuroni per sostituire quelli che sono danneggiati da inquinamento batterico delle infezioni virali. Questo neurogenesi permanente è sostenuta da progenitori, ma anche le cellule staminali che risiedono all&#39;interno di entrambi i compartimenti della mucosa, cioè il neuroepitelio e la sottostante lamina propria a 8-10. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo per purificare le cellule staminali adulte si trova nella lamina propria e, dopo aver dimostrato che essi sono strettamente legate alle cellule staminali del midollo osseo mesenchimali (MSC-BM), abbiamo chiamato le olfattiva ecto-le cellule staminali mesenchimali (OE- MSC) 11. Interessante notare che, rispetto a BM-MSC, OE-MSC visualizzare un alto tasso di proliferazione, un clonogenicità elevato e una tendenza a differenziarsi in cellule neurali. Abbiamo approfittato di queste caratteristiche per svolgere studi dedicati a svelare nuovi geni candidati nella schizofrenia e 4 morbo di Parkinson. Noi e gli altri hanno anche dimostrato che OE-MSC sono promettenti candidati per la terapia cellulare, dopo un trauma del midollo spinale 12,13, un danno cocleare 14 o in un modello animale del morbo di Parkinson 15 o amnesia 16. In questo studio, presentiamo i metodi per la biopsia della mucosa olfattiva nei ratti e gli esseri umani. Dopo la raccolta, la lamina propria è enzimaticamente separato dal epitelio e le cellule staminali sono purificate utilizzando un enzimatici o un non-metodo enzimatico. Purificato le cellule staminali olfattive possono quindi essere coltivate in gran numero e sopraelevate in azoto liquido o indotto a formare sfere o differenziate in cellule nervose. Queste cellule staminali possono essere utilizzati anche per omiche comparativa (genomica, trascrittomica, epigenomic, proteomica) studi.

Descriviamo qui un metodo per biopsying mucosa olfattiva di ratto e umano cavità nasali. Queste biopsie può essere usato sia per identificare le anomalie molecolari nelle malattie cerebrali o isolare le cellule staminali adulte multipotenti che possono essere utilizzati per il trapianto di cellule in modelli animali di trauma cerebrale / malattia

Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

La mucosa olfattiva, situata nella cavità nasale, è responsabile della rilevazione degli odori. È inoltre l'unico tessuto nervoso esposto all'esterno...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule staminali olfattive nasali da ratti o esseri umani al fine di identificare anomalie molecolari o riparare il cervello patologico o traumatizzato. Questo viene ottenuto innanzitutto prelevando chirurgicamente biopsie della mucosa olfattiva dalla cavità nasale. Successivamente, si elimina l'epitelio olfattivo e le sue cellule staminali epiteliali per concentrarsi sulle cellule staminali ecto-mesenchimali presenti nella lamina propria sottostante, quindi si isolano tali cellule dissociano il tessuto del roditore o raccogliendo le cellule in uscita da impianti umani coltivati sotto coprioggetti di vetro.L'ultimo passaggio della procedura consiste nel coltivare sferoidi di cellule staminali inducendo la differenziazione in cellule simili a neuroni. In definitiva, da un espianto dell'intera mucosa olfattiva si ottengono cellule staminali singole. Sferoidi in sospensione o cellule simili a neuroni possono essere utilizzati per identificare marcatori molecolari nelle malattie cerebrali o per riparare i danni al sistema nervoso.Descriviamo il suo metodo per isolare cellule staminali nasali umane e di roditore dalla mucosa olfattiva. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le cellule staminali appartengono a un tessuto nervoso, sono facilmente accessibili in ogni individuo vivente e possono essere utilizzate per diagnosticare o riparare il cervello affetto da patologie. Come chirurgo otorinolaringoiatra, ho eseguito centinaia di biopsie nasali per divertimento in studi clinici.La procedura è sicura e può essere eseguita. E l'anestesia generale locale. Sono uno scienziato junior con competenze nella coltura di cellule staminali umane o di roditore, nasali o fattoriali.Queste presentano un'elevata velocità di preparazione e una tendenza a differenziarsi in tipi cellulari neuronali. Si sono dimostrate efficaci in modelli animali di amnesia e di malattia neurodegenerativa. Prima del prelievo delle biopsie di mucosa, si utilizzano piastre Petri da 35 mm contenenti mezzo di coltura DMEM/Ham F12, preparato in una cappa a flusso laminare sterile.Ora, dopo aver verificato mediante la compressione delle dita dei piedi che il ratto è entrato in anestesia profonda con pentobarbital sodico, praticare l'eutanasia mediante decapitazione. Isolare la testa e rimuovere la pelle. Rimuovere la mandibola inferiore con le forbici e, con l'aiuto del proprio giurato, eliminare i muscoli facciali su entrambi i lati a partire dalla parte posteriore degli incisivi.Utilizzando il Ron Jur, rimuovere l'osso che ricopre la cavità nasale un lato alla volta. I turbinati olfattivi appaiono come organi di colore arancione o marrone situati nella parte posteriore del naso; rimuovere delicatamente i turbinati con la pinzetta.Utilizzando un ago da 26 gauge, isolare la mucosa olfattiva che si trova sul setto tagliando il tessuto lungo tre linee: l'arco della lamina perpendicolare, la lamina del CRI e il tetto della cavità nasale. Raccogliere biopsie da entrambi i lati e trasferirle in una piastra di Petri riempita con A-D-M-E-M ham F 12. Questa procedura non deve richiedere più di 10 minuti a partire dall'inizio dell'eutanasia.Ora, per rimuovere il muco, trasferire i prelievi due volte in piatti di Petri contenenti mezzo, in conformità con i pertinenti comitati etici locali. Questa procedura deve essere eseguita da un chirurgo otorinolaringoiatra e ogni paziente ambulatoriale deve firmare un modulo di consenso informato, utilizzando un endoscopio rigido a zero gradi o a 30 gradi. Ispezionare entrambe le cavità nasali e valutare la presenza presunta di polipi o di qualsiasi lesione infiammatoria.Scegliere la migliore cavità nasale tenendo conto della deviazione del setto. Applicare con un applicatore di cotone un anestetico locale, come la lidocaina con epinefrina, per 10 minuti effettuando un taglio trasversale. Con pinze etmoidali prelevare un campione bioptico di due millimetri quadrati alla radice dell'aspetto mediale del turbinato medio oppure sul setto nella regione mediale dorsale.Qui mostriamo il campione prelevato dalla zona radicolare. Il campione olfattivo viene quindi trasferito, mediante un ago sterile, in un tubo sterile da due millilitri contenente un millilitro di DMEM/F12. Capovolgere il tubo delicatamente per assicurarsi che il campione sia completamente immerso nel mezzo di coltura.Inserire il tubo in un contenitore refrigerato e trasportarlo al laboratorio di ricerca. A questo stadio, la biopsia può essere utilizzata direttamente per studi molecolari comparativi focalizzati su specifiche malattie cerebrali oppure processata per generare cellule staminali. Lavare le biopsie umane o di ratto e incubare le biopsie in una piastra di Petri riempita con un millilitro di dis paste in DMEM ham F 12.Due soluzioni per un'ora a 37 gradi Celsius. Successivamente, l'epitelio olfattivo umano o di ratto viene rimosso dalla lamina propria sottostante utilizzando una spatola microchirurgica al microscopio stereoscopico con luce trasmessa deviata. L'epitelio olfattivo appare traslucido su sfondo nero, a differenza della lamina propria, che presenta striature arancio-brune su sfondo bianco.L'epitelio appare grigio e la lamina propria marrone una volta purificata; trasferire la lamina propria in una piastra di Petri contenente DMEM/F12. Se il tessuto proviene da un roditore, tagliare la lamina propria in piccoli pezzi utilizzando due aghi da 25 gauge. Successivamente, trasferire i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente un millilitro di collagenasi tipo I A nel tubo, usando una pipetta di plastica sterile per dissociare il tessuto.Quindi incubare il tubo per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Per interrompere la dissociazione, agitare delicatamente il tubo e aggiungere millilitri di PBS privo di calcio e magnesio e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Ripesare, sospendere il pellet cellulare nel mezzo di coltura e coltivare su piatti di plastica.Ora, se il tessuto è umano, tagliare il limone in modo appropriato in tre o quattro pezzi. Inserire ogni striscia in un proprio pozzetto di due centimetri di diametro in una piastra a quattro pozzetti e coprire il tessuto con coprioggetti di vetro sterili di 1,3 centimetri di diametro.Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura in ogni piastra di coltura per entrambi i tipi di tessuto. Rinnovare il mezzo di coltura ogni due o tre giorni. Dopo cinque a sette giorni di coltura, le cellule staminali inizieranno a invadere la piastra di coltura.Dopo due settimane, le cellule dovrebbero essere confluenti. Quando si raggiunge la confluenza, effettuare il passaggio e trasferire le cellule in fiaschi di coltura per generare sferoidi di cellule staminali.Ripiantare le cellule a una densità di 16.000 cellule per centimetro quadrato in flaconi pretrattati ogni due giorni. Nutrire le cellule con 0,2 millilitri per centimetro quadrato di mezzo integrato. Due-cinque giorni dopo, raccogliere le sferoidi cellulari in sospensione e riutilizzarle o dissociazione prima del trapianto.Un modello animale di terapia cellulare per differenziare le cellule staminali olfattive in cellule simili a neuroni. Coltivare le cellule per 21 giorni in mezzo neurobasale contenente B27, penicillina, streptomicina, glutammina e glutammato, quindi effettuare il cambio del mezzo ogni tre giorni. Le cellule simili a neuroni dovrebbero apparire dopo due o tre settimane, da cinque a sette giorni dopo la semina.Le cellule staminali olfattive umane nasali sono cresciute dall'espianto e si sono proliferate rapidamente. La confluenza poteva essere raggiunta entro una o due settimane. Una caratteristica fondamentale delle cellule staminali, la formazione di nidi e l'espressione, è stata valutata quando le cellule sono state coltivate su polilisina con un mezzo di coltura privo di siero, integrato con EGF e FGF2; le cellule staminali olfattive hanno generato sfere quando queste ultime sono state seminate in un mezzo di coltura contenente siero.Mezzo, hanno dato origine a popolazioni cellulari contenenti circa il 50% di cellule esprimenti GFAP, fino al 15% di cellule esprimenti tubulina e fino al 5% di cellule esprimenti oh quattro. Quando le cellule derivate da sferoidi sono state coltivate in mezzo di coltura neurobasale supplementato, la maggior parte della popolazione è diventata cellule simili a neuroni che esprimevano beta tre tubulina. Le stesse cellule simili a neuroni esprimevano anche map due.Pertanto, il destino delle cellule staminali potrebbe essere modificato in un semestre. Questa tecnica può generare facilmente milioni di cellule staminali in meno di quattro settimane, consentendo ai clinici di eseguire futuri trapianti cellulari autologhi. Le biopsie refrattarie nasali sono molto utili per identificare biomarcatori e malattie cerebrali.Recentemente siamo riusciti a identificare nuovi geni candidati per l'autismo. Abbiamo già allestito una biobanca di cellule staminali olfattive provenienti da individui autistici e da controlli, che può essere estesa ad altre patologie cerebrali umane.

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