Name: Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 32 s
Description: Impara l'estrazione del DNA da campioni tissutali inclusi in paraffina (FFPE) per analisi genetiche ed epigenetiche. Questo metodo fornisce DNA di alta qualità per studi di biologia molecolare.

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Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lam per la loro valutazione e critiche di questo video e articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute.

<p class="jove_title"&gt; 1. Note procedurali</p&gt;<ul&gt;<li&gt; Xilene e fenoli sono sostanze chimiche tossiche e devono essere manipolati in un fumehood. Consultare la scheda dati di sicurezza (MSDS) prima dell&#39;uso.</li&gt;<liXilene&gt; dissolve in plastica, tubi in polipropilene dovrebbe essere usato come tollerano questi composti.</li&gt;<liSuggerimenti&gt; speciali possono essere acquistati che contengono un tappo interno carbone. Questo impedisce lo xilene da sciogliere i componenti in gomma nella pipetta. In alternativa, filtro può essere usato.</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 2. Paraffina rimozione</p&gt;<ol&gt;<li&gt; In un fumehood, aggiungere 800 ml di xilene (VWR, CABDH6216-4) per la provetta contenente il campione e posto su una sedia a dondolo agitando delicatamente per 5 a 15 minuti per sciogliere la paraffina.</li&gt;<li&gt; Pellet il campione facendo girare alla massima velocità (14.000 giri al minuto o 16 000 xg) in una microcentrifuga per 3 minuti. Rimuovere con attenzione il sopranatante xilene e smaltire in un tubo di polipropilene per smaltire i rifiuti xilene. Fare attenzione a non disturbare il pellet.</li&gt;<li&gt; Ripetere le fasi di lavaggio xilene 1 e paraffina 2until è completamente sciolto. Questo di solito richiede 2-3 lavaggi, a seconda delle dimensioni del campione di tessuto. Un campione completamente sciolto apparirà morbida, e talvolta perde la sua integrità strutturale. L&#39;integrità del campione può essere valutata delicatamente con la punta della pipetta.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 3. Etanolo reidratazione</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Aggiungere 800 ml di etanolo al 100% (v / v) di grado biologia molecolare etanolo, vortice, gioca per 3 minuti a 14.000 rpm in microcentrifuga. Rimuovere il surnatante etanolo, facendo attenzione a non disturbare il pellet.</li&gt;<li&gt; Aggiungere 800 ml di etanolo al 70% (100% (v / v) di etanolo diluito in acqua distillata (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortice, e girare per 3 minuti a 14.000 giri al minuto. Rimuovere con attenzione il sopranatante etanolo.</li&gt;<li&gt; Aggiungere 800 ml di etanolo al 50% (100% (v / v) di etanolo diluito in acqua distillata (dH<sub&gt; 2</sub&gt; O)), vortice, e girare per 5 minuti a 14.000 giri al minuto. Rimuovere con cura come l&#39;etanolo più possibile pipettando. Fare molta attenzione di disturbare il pellet a questo punto come tessuto completamente reidratato non pellet così come i tessuti disidratati.</li&gt;<li&gt; Dopo aver rimosso il supernatante etanolo, asciugare il pellet per 5 minuti, facendo attenzione a non troppo secco.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 4. Tessuto digestione</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Aggiungere 200-500 ml di Lysis Buffer (formula di seguito). Risospendere il pellet con un puntale o un vortice. Sforzo in più a questo punto completamente ri-sospendere il tessuto si tradurrà in una digestione più completa del campione e un rendimento migliore di DNA.</li&gt;<li&gt; Incubare campioni a 56 ° C in un bagnomaria o dal blocco di riscaldamento.</li&gt;<li&gt; Per i nuclei di tessuto, spike 20 l di proteinasi K (20 mg / ml di soluzione concentrata, Invitrogen, AM2548) mattina e sera.</li&gt;<li&gt; Ripetere i passaggi precedenti digestione per 2 a 5 giorni fino a quando il tessuto è completamente sciolto.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_step"&gt; Lysis Buffer</p<ul&gt;<li&gt; 10 mM Tris-HCl pH 8.0</li&gt;<li&gt; 100 mM EDTA pH 8.0</li&gt;<li&gt; 50 mM NaCl</li&gt;<li&gt; 0,5% SDS</li&gt;<li&gt; 200 mg / ml di proteinasi K (aggiungere al momento dell&#39;uso)</li&gt;</ul&gt;<p class="jove_title"&gt; 5. DNA ripulire</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Aggiungi un uguale volume di tampone saturo fenolo (Fisher, BP1750I-400) e mescolare per inversione. Spin per almeno 5 minuti a 14.000 rpm in microcentrifuga.</li&gt;<li&gt; Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. Nota l&#39;interfase: c&#39;è un sacco di materiale bianco?</li&gt;<li&gt; Ripetere i passaggi 1 e 2 sulla frazione acquosa fino a quando l&#39;interfase è chiaro (di solito 3 o più volte). Eseguire indietro estrazioni * quando l&#39;interfase è fuzzy per aumentare la resa finale.</li&gt;<li&gt; Una volta che l&#39;interfase è chiaro, aggiunge un uguale volume di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25:24:1) (Fisher, BP1752I-400) per la frazione estratto acquoso del campione. Mescolare per 5 minuti e poi girare per 5 minuti a 14.000 rpm. Thisreduces residuo fenolo e acuisce ulteriormente l&#39;interfase, facilitando l&#39;estrazione dello strato acquoso</li&gt;<li&gt; Rimuovere lo strato acquoso in una nuova provetta e treatwith RNase A a 100 mg / ml per 1 ora a 37 ° C.</li&gt;<li&gt; Ripetere i passaggi da 1 a 4 per togliere ogni residuo RNase A e raccogliere la frazione acquosa. Si deve solo bisogno di 1 o 2 passi tampone saturo fenolo come ci dovrebbe essere molto meno proteine ​​per rimuovere rispetto al lisato iniziale.</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_content"&gt; * Per eseguire indietro estrazioni aggiungere 50-100 ml di dH<sub&gt; 2</sub&gt; 0 per la provetta contenente l&#39;interfase e la parte organica. Capovolgere la provetta per mescolare, e far girare il campione a 14.000 rpm in una microcentrifuga per 5 minuti. Raccogliere la fase acquosa e aggiungerlo alla estrazione precedentemente acquisite acquosa. Continua indietro estrazioni fino a quando l&#39;interfase è chiara.</p&gt;<p class="jove_title"&gt; 6. DNA precipitazioni</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Valutare il volume del vostro strato acquoso raccolti.</li&gt;<li&gt; Aggiungi 1 / 10 del volume di 3 M di sodio acetato pH 5.2 e 1 volume di isopropanolo 100% (v / v) di grado biologia molecolare (o 2,5 volumi di etanolo 100%).</li&gt;<li&gt; Mescolare bene e mettere in ghiaccio o in congelatore a -20 ° C per 30 minuti o durante la notte.</li&gt;<liSpin&gt; alla massima velocità (14.000 rpm) a 4 ° C in microcentrifuga per 10 minuti</li&gt;<li&gt; Eliminare il supernatante.</li&gt;<li&gt; Lavare il pellet con etanolo al 70% del ghiaccio fredda per eliminare i sali indesiderati.</li&gt;<li&gt; Risospendere il pellet nel buffer di scelta (di solito dH<sub&gt; 2</sub&gt; O).</li&gt;</ol&gt;<p class="jove_title"&gt; 7. Quantificazione del DNA</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Quantificare la concentrazione del DNA. La A260: A280 rapporto dovrebbe essere ~ 1.8. Per piccole quantità di DNA, la misurazione utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop è preferito.</li&gt;<liQuantificazione&gt; In seguito, elettroforesi su gel deve essere effettuata per testare la qualità del vostro campione di DNA e RNA stabilire se la contaminazione è stata completamente degradata.</li&gt;<li&gt; Alta qualità del DNA estratto è adatto per applicazioni a valle, oppure possono essere conservati a -20 ° C per un uso successivo. Se l&#39;RNA è ancora presente nel campione, ripetere il DNA ripulire e passi precipitazioni, e ri quantificare e qualificare la qualità dei vostri campioni.</li&gt;</ol&gt;

<ol><li>Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+genomic+DNA+from+paraffin-embedded+tissue+sections+of+human+fetuses+fixed+and+stored+in+formalin+for+long+periods%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods.</a> Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).</li>
<li>Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proteinase+K+action+by+denaturing+agents%3A+application+to+the+isolation+of+nucleic+acids+and+the+degradation+of+%27masked%27+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins.</a> Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).</li>
<li>Sambrook, J. oseph, R, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+Joseph+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).</li>
<li>Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+demonstration+of+whole+genome+array+comparative+genomic+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Thu, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+DNA+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methylated DNA immunoprecipitation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Cold Spring Harb Protoc. , (2009).</li>
<li>Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Extraction+from+Paraffin-Embedded+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pathology+Protocols%22%5BJournal%5D)">DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues.</a> Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Tessuti sottoposte a biopsia o asportato chirurgicamente per l&#39;analisi istopatologica e la diagnosi sono spesso fissati in formalina e paraffina (FFPE) per la conservazione a lungo termine. Con il crescente interesse per comprendere le basi genetiche della malattia, la capacità di estrarre DNA da questi campioni rappresenta una preziosa fonte di materiale diagnostico che può essere utilizzato per l&#39;analisi e gli studi di genomica traslazionale. Storicamente campioni FFPE non sono state considerate una valida fonte per l&#39;analisi molecolare degli acidi nucleici possono essere fortemente modificati dagli acidi nucleici e proteine-proteina-proteina reticolazione 6. Tuttavia, la scoperta che la digestione della proteasi rilascia frammentato acidi nucleici che sono adatti per le analisi a valle tra cui PCR, array CGH, la sequenza e profili di metilazione, consente l&#39;utilizzo di questi esemplari preziosi per l&#39;analisi genetica 6. Estrazione del DNA da tessuti inclusi in paraffina è una procedura robusta che si basa sulla solubilità differenziale per purificare il DNA. Qualità del DNA estratto e quantità e il successo di amplificazione del DNA successive dipende da una serie di parametri prima, durante e dopo l&#39;estrazione. Questi includono, ma non solo: tipo e la quantità di tessuto, il tipo di fissativo utilizzati per la conservazione dei tessuti, la durata della fissazione, età del blocco di paraffina e condizioni di conservazione, così come la lunghezza del segmento di DNA desiderato di essere amplificato 1,7. Rimozione della paraffina dal tessuto è la fase più critica per l&#39;estrazione di successo come paraffina indisciolto porta a scarsa qualità del campione e l&#39;inibizione della PCR.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Xilene </td><td> VWR </td><td> CABDH6216-4 </td><td> - </td></tr><tr><td> Tubi 1,7 ml Microcentrifuga SafeSeal </td><td> BioScience Sorenson </td><td> 11510 </td><td> - </td></tr><tr><td> Spectrafuge Microcentrifuga 16M </td><td> Labnet </td><td> C0160-B </td><td> - </td></tr><tr><td> Lysis Buffer </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 200 mg / ml di proteinasi K </td></tr><tr><td> Proteinasi K Soluzione </td><td> Invitrogen </td><td> AM2548 </td><td> 20 mg / ml </td></tr><tr><td> Proteinasi K Soluzione </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampone saturo pH fenolo 6.6/7.9 </td><td> Pescatore </td><td> BP1750I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> Fenolo: cloroformio: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) </td><td> Pescatore </td><td> BP1752I-400 </td><td> - </td></tr><tr><td> RNase A </td><td> Roche </td><td> 10109169001 </td><td> 100mg </td></tr><tr><td> 3M sodio acetato pH 5,2 </td><td> - </td><td> - </td><td> 40.81g NaOAc in 80ml Aggiustare il pH 5.2 con acido acetico glaciale Aggiungi dH 2 O a 100 ml Autoclave </td></tr><tr><td> ND 3300 Spettrofotometro </td><td> NanoDrop </td><td> - </td><td> - </td></tr></tbody></table>

estrazione dna da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

 DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Sviluppo e la progressione della malattia sono caratterizzate da frequenti aberrazioni genetiche ed epigenetiche tra riarrangiamenti cromosomici, gli utili e le perdite numero di copie e la metilazione del DNA. I progressi nella high-throughput, genome-wide tecnologie di profilazione, quali microarray, hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di identificare e rilevare queste alterazioni specifiche. Tuttavia, come la tecnologia continua a migliorare, un fattore limitante rimane la qualità del campione e la disponibilità. Inoltre, il follow-up i dati clinici ed esito della malattia sono spesso raccolti anni dopo la raccolta del campione iniziale. I campioni, tipicamente fissati in formalina e paraffina (FFPE), sono conservati in archivi ospedale per gli anni a decenni. DNA può essere efficiente ed efficace recuperato da campioni inclusi in paraffina, se il metodo appropriato di estrazione è applicata. DNA di alta qualità estratto da campioni correttamente conservati e archiviati in grado di supportare analisi quantitative per il confronto di tessuti sani e malati e la generazione di firme genetiche ed epigenetiche 1. Per estrarre il DNA da campioni inclusi in paraffina, nuclei di tessuto o tessuto microdissezionate sono sottoposti a un trattamento xilene, che dissolve la paraffina dal tessuto, e poi reidratato con una serie di lavaggi etanolo. Proteine ​​ed enzimi dannosi come nucleasi sono successivamente digeriti dalle proteinasi K. L&#39;aggiunta di tampone di lisi, che contiene agenti denaturanti come dodecil solfato di sodio (SDS), facilita la digestione 2. Gli acidi nucleici sono purificati dal lisato tessuto utilizzando tampone saturi centrifugazione ad alta velocità fenolo e che genera una soluzione bifasica. DNA e RNA rimane nella fase acquosa superiore, mentre le proteine, lipidi e polisaccaridi sono sequestrate in inter-e organico-fasi, rispettivamente. Ritenzione della fase acquosa e ripetuto fenolo genera un campione pulito. A seguito di fenolo, RNasi A è aggiunto per eliminare l&#39;RNA contaminanti. Ulteriori fenolo dopo incubazione con RNase A sono usati per rimuovere qualsiasi enzima rimanenti. L&#39;aggiunta di acetato di sodio e il DNA isopropanolo precipita, e la centrifugazione ad alta velocità è usato per far sedimentare il DNA e facilitare la rimozione isopropanolo. Sali in eccesso derivanti dal precipitazioni possono interferire con le successive saggi enzimatici, ma possono essere rimosse dal DNA di lavaggio con etanolo al 70%, seguita da centrifugazione di ri-pellet il DNA 3. Il DNA è risospeso in acqua distillata o il buffer di scelta, quantificati e conservati a -20 ° C. DNA purificato può essere successivamente utilizzato in applicazioni a valle che includono, ma non sono limitati a, PCR, ibridazione genomica comparativa serie 4 (array CGH), Immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP) e sequenziamento, consentendo un&#39;analisi integrativa di campioni di tessuto / tumore.

Questo video dimostra il protocollo per l&#39;estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

Lo sviluppo e la progressione della malattia sono caratterizzati da frequenti aberrazioni genetiche ed epigenetiche, tra cui riarrangiamenti cromosomici, variazioni del numero di copie...

In questo video verrà illustrato come estrarre il DNA da campioni di tessuto inclusi in paraffina. Il campione utilizzato in questa dimostrazione è un'ampia di tessuto di tre millimetri di diametro e sei millimetri di lunghezza. Sebbene in questa dimostrazione venga utilizzata una singola ampia, campioni più grandi con diametro superiore a cinque millimetri e lunghezza superiore a dieci millimetri, oppure due o tre ampie delle dimensioni utilizzate qui, possono essere processati in una singola reazione.Tuttavia, è importante notare che potrebbero essere necessari degli aggiustamenti al protocollo per garantire la completa rimozione della paraffina e la digestione del tessuto. Prima di effettuare qualsiasi operazione sul tessuto, la paraffina cerosa che lo conserva deve essere disciolta. Questo viene ottenuto utilizzando xilolo, poiché xilolo e fenolo sono tossici. Qualsiasi lavoro con questi composti chimici deve essere eseguito in una cappa aspirante; aggiungere 800 microlitri di xilolo al tubo contenente il campione.Quindi posizionare il campione su un agitatore per 10 minuti con agitazione delicata. Centrifugare il campione a 14.000 giri/min per tre minuti per formare il pellet e quindi rimuovere il xilene e sciogliere la paraffina dal tubo. Ripetere questi passaggi due o tre volte fino a quando la paraffina non sarà completamente sciolta.Il tessuto dovrebbe apparire umido e morbido. È importante rimuovere tutto il paraffino per aumentare il rendimento finale di DNA. Pertanto, sono necessari ulteriori lavaggi per campioni di tessuto più grandi.Ora che la paraffina è stata rimossa dal campione, il tessuto deve essere reidratato per consentire la digestione del tessuto. Questo passaggio viene eseguito utilizzando una serie di etanolo per la reidratazione. Aggiungere prima 800 microlitri di etanolo al 100% al campione, vortexare e centrifugare il campione a 14.000 giri al minuto per tre minuti.Rimuovere il soprannatante. Ripetere questi passaggi utilizzando 800 microlitri di etanolo al 70% e successivamente con etanolo al 50%. L'ultima centrifugazione deve durare cinque minuti poiché il tessuto sarà meno solido e richiederà una forza maggiore per formare il pellet.Ora il tessuto deve essere digerito per liberare il DNA dalle cellule. Questo viene fatto utilizzando un buffer di lisi, una soluzione composta da agenti denaturanti proteici, come l'SDS e la proteinasi K, l'enzima responsabile della degradazione del tessuto.Aggiungere da 200 a 500 microlitri di buffer di lisi al campione. A seconda delle dimensioni, 400 microlitri rappresenta un volume adeguato. Inoltre, i componenti del buffer di lisi e la temperatura di incubazione di 56 gradi Celsius sono finalizzati a massimizzare l'attività proteica.ACE K. Poiché la proteina ACE K può degradare il tessuto solo per un periodo limitato, è necessario aggiungere enzima periodicamente per proseguire la reazione. Vengono aggiunti 20 microlitri di proteina ACE K a una concentrazione di 10 milligrammi per M al campione ogni mattina e sera fino a quando il tessuto non sarà completamente disciolto.Quando non si riesce più a vedere tessuto solido, il DNA deve essere estratto dal tampone contenente i detriti cellulari. Il fenolo saturo viene utilizzato per separare il campione in fasi acquosa e organica. La fase acquosa contiene il DNA.È importante utilizzare fenolo saturo con tampone perché l'acidità del fenolo normale non solo degrada il DNA, ma inverte anche la stratificazione delle fasi acquosa e organica. Si tenga presente che il fenolo saturo con tampone viene conservato in due fasi, con il fenolo che costituisce lo strato inferiore.Aggiungere un volume uguale di fenolo saturo con tampone al campione e capovolgere il tubo diverse volte. Successivamente, posizionare il campione nella centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 14.000 giri/min per cinque minuti per indurre la separazione delle fasi.Il DNA e l'RNA si troveranno nella fase acquosa superiore, mentre le proteine, i lipidi e i polisaccaridi si troveranno nella fase intermedia e nella fase organica inferiore. Rimuovere con attenzione lo strato acquoso senza disturbare la fase intermedia e trasferirlo in un nuovo tubo. Spesso, dopo la prima centrifugazione, l'interfaccia è sciolta e arretrata.Sono necessarie estrazioni utilizzando piccoli volumi di acqua. Il protocollo per le estrazioni inverse è descritto nel testo accompagnatorio a questo video. Ripetere questi passaggi fino a quando l'interfaccia risulta limpida, condizione generalmente raggiunta dopo tre a cinque ripetizioni, quindi procedere aggiungendo un volume uguale di fenolo cloroformio, alcol isoamilico al campione di DNA.Questo svolge la stessa funzione del fenolo da solo, ma definisce meglio l'interfaccia per massimizzare il rendimento di DNA. Ripetere questa procedura una o due volte fino a quando l'interfaccia risulta chiara e ben definita. Ora che il campione è privo di proteine, qualsiasi RNA contaminante deve essere rimosso.Questo viene ottenuto grazie agli RNA. Un RNA di degradazione A viene aggiunto al campione a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e il campione viene incubato per un'ora a 37 gradi Celsius. Ora che l'RNA è stato degradato, l'enzima RNAA deve essere rimosso.La procedura di purificazione del DNA viene ripetuta come in precedenza. Utilizzando prima fenolo saturo con tampone e poi passando a fenolo-cloroformio-isoamilo, saranno necessari meno passaggi di purificazione poiché l'unica contaminazione presente è ormai costituita dall'enzima RNAasi A e dall'RNA degradato. Ora che il campione contiene solo DNA, il DNA deve essere precipitato dalla soluzione aggiungendo un decimo del volume di acetato di sodio e un volume di isopropanolo.In alternativa, è possibile aggiungere due volumi e mezzo di etanolo, ma in tal caso sarebbe necessaria una provetta più grande. Incubare il campione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti fino a un'ora, oppure durante la notte se si lavora in orario serale. Ora che si sta lavorando con il DNA, assicurarsi che il campione rimanga sul ghiaccio per evitare che si degradi.Centrifugare il campione a 14.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet del DNA precipitato. Rimuovere il soprannatante avendo cura di non disperdere il pellet, al fine di eliminare i sali in eccesso che potrebbero interferire con esperimenti successivi come il sequenziamento. Ad esempio, aggiungere un millilitro di etanolo al 70% freddo e risospendere delicatamente il campione.Centrifugare nuovamente il campione a 14.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il soprannatante e lasciare asciugare all'aria l'eccesso di etanolo per un massimo di cinque minuti. È importante non eccessivamente essiccare il campione.Infine, il DNA viene purificato ed è pronto per essere risospeso nel tampone di vostra scelta. Qui stiamo utilizzando acqua distillata autoclavata. Oh sì.Conservare i campioni di DNA a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. Al termine dell'estrazione, è necessario valutare la qualità e la quantità del DNA ottenuto. Questa analisi viene effettuata mediante spettrometria utilizzando il NanoDrop tre 30 nd, impostando il tipo di misura su acido nucleico, selezionando DNA 50 come parametro di calcolo e inizializzando lo strumento con 1,5 microlitri di acqua.Pulire il piedistallo ed eseguire una misurazione di bianco utilizzando 1,5 microlitri di diluente. In questo caso, acqua distillata. Pulire il piedistallo, caricare 1,5 microlitri di campione ed eseguire la misurazione. Sì. Ottimo.Un rapporto A260/A280 di 1,8 è ideale in questa fase. Il tuo DNA è pronto per essere utilizzato in applicazioni successive, che includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo: array, ibridazione genomica comparativa, immunoprecipitazione del DNA metilato e sequenziamento.I collegamenti per questi protocolli sono mostrati qui, se non necessari immediatamente. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo.

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Profilazione delle mutazioni del DNA del recettore del fattore di crescita epidermico nelle cellule rare circolanti utilizzando un sistema di isolamento cellulare e PCR digitale a gocce

Descriviamo un metodo per l'estrazione di alto peso molecolare del DNA genomico da biomassa planctonica concentrati su filtri 0,22 micron Sterivex, seguita da centrifugazione in gradiente di cesio cloruro di densità per la purificazione.

Estrazione del DNA da 0,22 Filtri mM Sterivex e cloruro di Cesio densità centrifugazione gradiente

Una metodologia per isolare ad alto peso molecolare del DNA genomico e di alta qualità da parte della comunità microbica del suolo è descritta.

Estrazione di DNA ad alta peso molecolare genomico da terreni e sedimenti

Impara l'estrazione del DNA da campioni tissutali inclusi in paraffina (FFPE) per analisi genetiche ed epigenetiche. Questo metodo fornisce DNA di alta qualità per studi di biologia molecolare.

Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

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