Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche

In questo video verrà illustrato come estrarre il DNA da campioni di tessuto inclusi in paraffina. Il campione utilizzato in questa dimostrazione è un'ampia di tessuto di tre millimetri di diametro e sei millimetri di lunghezza. Sebbene in questa dimostrazione venga utilizzata una singola ampia, campioni più grandi con diametro superiore a cinque millimetri e lunghezza superiore a dieci millimetri, oppure due o tre ampie delle dimensioni utilizzate qui, possono essere processati in una singola reazione.

Tuttavia, è importante notare che potrebbero essere necessari degli aggiustamenti al protocollo per garantire la completa rimozione della paraffina e la digestione del tessuto. Prima di effettuare qualsiasi operazione sul tessuto, la paraffina cerosa che lo conserva deve essere disciolta. Questo viene ottenuto utilizzando xilolo, poiché xilolo e fenolo sono tossici. Qualsiasi lavoro con questi composti chimici deve essere eseguito in una cappa aspirante; aggiungere 800 microlitri di xilolo al tubo contenente il campione.

Quindi posizionare il campione su un agitatore per 10 minuti con agitazione delicata. Centrifugare il campione a 14.000 giri/min per tre minuti per formare il pellet e quindi rimuovere il xilene e sciogliere la paraffina dal tubo. Ripetere questi passaggi due o tre volte fino a quando la paraffina non sarà completamente sciolta.

Il tessuto dovrebbe apparire umido e morbido. È importante rimuovere tutto il paraffino per aumentare il rendimento finale di DNA. Pertanto, sono necessari ulteriori lavaggi per campioni di tessuto più grandi.

Ora che la paraffina è stata rimossa dal campione, il tessuto deve essere reidratato per consentire la digestione del tessuto. Questo passaggio viene eseguito utilizzando una serie di etanolo per la reidratazione. Aggiungere prima 800 microlitri di etanolo al 100% al campione, vortexare e centrifugare il campione a 14.000 giri al minuto per tre minuti.

Rimuovere il soprannatante. Ripetere questi passaggi utilizzando 800 microlitri di etanolo al 70% e successivamente con etanolo al 50%. L'ultima centrifugazione deve durare cinque minuti poiché il tessuto sarà meno solido e richiederà una forza maggiore per formare il pellet.

Ora il tessuto deve essere digerito per liberare il DNA dalle cellule. Questo viene fatto utilizzando un buffer di lisi, una soluzione composta da agenti denaturanti proteici, come l'SDS e la proteinasi K, l'enzima responsabile della degradazione del tessuto.

Aggiungere da 200 a 500 microlitri di buffer di lisi al campione. A seconda delle dimensioni, 400 microlitri rappresenta un volume adeguato. Inoltre, i componenti del buffer di lisi e la temperatura di incubazione di 56 gradi Celsius sono finalizzati a massimizzare l'attività proteica.

ACE K. Poiché la proteina ACE K può degradare il tessuto solo per un periodo limitato, è necessario aggiungere enzima periodicamente per proseguire la reazione. Vengono aggiunti 20 microlitri di proteina ACE K a una concentrazione di 10 milligrammi per M al campione ogni mattina e sera fino a quando il tessuto non sarà completamente disciolto.

Quando non si riesce più a vedere tessuto solido, il DNA deve essere estratto dal tampone contenente i detriti cellulari. Il fenolo saturo viene utilizzato per separare il campione in fasi acquosa e organica. La fase acquosa contiene il DNA.

È importante utilizzare fenolo saturo con tampone perché l'acidità del fenolo normale non solo degrada il DNA, ma inverte anche la stratificazione delle fasi acquosa e organica. Si tenga presente che il fenolo saturo con tampone viene conservato in due fasi, con il fenolo che costituisce lo strato inferiore.

Aggiungere un volume uguale di fenolo saturo con tampone al campione e capovolgere il tubo diverse volte. Successivamente, posizionare il campione nella centrifuga ed eseguire la centrifugazione a 14.000 giri/min per cinque minuti per indurre la separazione delle fasi.

Il DNA e l'RNA si troveranno nella fase acquosa superiore, mentre le proteine, i lipidi e i polisaccaridi si troveranno nella fase intermedia e nella fase organica inferiore. Rimuovere con attenzione lo strato acquoso senza disturbare la fase intermedia e trasferirlo in un nuovo tubo. Spesso, dopo la prima centrifugazione, l'interfaccia è sciolta e arretrata.

Sono necessarie estrazioni utilizzando piccoli volumi di acqua. Il protocollo per le estrazioni inverse è descritto nel testo accompagnatorio a questo video. Ripetere questi passaggi fino a quando l'interfaccia risulta limpida, condizione generalmente raggiunta dopo tre a cinque ripetizioni, quindi procedere aggiungendo un volume uguale di fenolo cloroformio, alcol isoamilico al campione di DNA.

Questo svolge la stessa funzione del fenolo da solo, ma definisce meglio l'interfaccia per massimizzare il rendimento di DNA. Ripetere questa procedura una o due volte fino a quando l'interfaccia risulta chiara e ben definita. Ora che il campione è privo di proteine, qualsiasi RNA contaminante deve essere rimosso.

Questo viene ottenuto grazie agli RNA. Un RNA di degradazione A viene aggiunto al campione a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e il campione viene incubato per un'ora a 37 gradi Celsius. Ora che l'RNA è stato degradato, l'enzima RNAA deve essere rimosso.

La procedura di purificazione del DNA viene ripetuta come in precedenza. Utilizzando prima fenolo saturo con tampone e poi passando a fenolo-cloroformio-isoamilo, saranno necessari meno passaggi di purificazione poiché l'unica contaminazione presente è ormai costituita dall'enzima RNAasi A e dall'RNA degradato. Ora che il campione contiene solo DNA, il DNA deve essere precipitato dalla soluzione aggiungendo un decimo del volume di acetato di sodio e un volume di isopropanolo.

In alternativa, è possibile aggiungere due volumi e mezzo di etanolo, ma in tal caso sarebbe necessaria una provetta più grande. Incubare il campione a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti fino a un'ora, oppure durante la notte se si lavora in orario serale. Ora che si sta lavorando con il DNA, assicurarsi che il campione rimanga sul ghiaccio per evitare che si degradi.

Centrifugare il campione a 14.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius per formare il pellet del DNA precipitato. Rimuovere il soprannatante avendo cura di non disperdere il pellet, al fine di eliminare i sali in eccesso che potrebbero interferire con esperimenti successivi come il sequenziamento. Ad esempio, aggiungere un millilitro di etanolo al 70% freddo e risospendere delicatamente il campione.

Centrifugare nuovamente il campione a 14.000 giri/min per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il soprannatante e lasciare asciugare all'aria l'eccesso di etanolo per un massimo di cinque minuti. È importante non eccessivamente essiccare il campione.

Infine, il DNA viene purificato ed è pronto per essere risospeso nel tampone di vostra scelta. Qui stiamo utilizzando acqua distillata autoclavata. Oh sì.

Conservare i campioni di DNA a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. Al termine dell'estrazione, è necessario valutare la qualità e la quantità del DNA ottenuto. Questa analisi viene effettuata mediante spettrometria utilizzando il NanoDrop tre 30 nd, impostando il tipo di misura su acido nucleico, selezionando DNA 50 come parametro di calcolo e inizializzando lo strumento con 1,5 microlitri di acqua.

Pulire il piedistallo ed eseguire una misurazione di bianco utilizzando 1,5 microlitri di diluente. In questo caso, acqua distillata. Pulire il piedistallo, caricare 1,5 microlitri di campione ed eseguire la misurazione. Sì. Ottimo.

Un rapporto A260/A280 di 1,8 è ideale in questa fase. Il tuo DNA è pronto per essere utilizzato in applicazioni successive, che includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo: array, ibridazione genomica comparativa, immunoprecipitazione del DNA metilato e sequenziamento.

I collegamenti per questi protocolli sono mostrati qui, se non necessari immediatamente. Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo.