Trichuris Muris Infezione: un modello di tipo 2 Immunità e infiammazione nell'intestino

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire e mantenere un modello naturale di infezione da hain. Inizialmente, i topi vengono infettati con uova di tra curus mirrors mediante gavaggio orale. Ventuno giorni dopo, gli animali infetti vengono sottoposti a eutanasia e vengono prelevati sangue, linfonodi mesenterici, pellet fecali, colon e seeker.

Utilizzando questi campioni, è possibile analizzare la risposta immunitaria generata contro le trappole. Gli specchi possono essere analizzati. I campioni di siero possono essere analizzati mediante lisato per rilevare anticorpi specifici per TRA.

La risimulazione in vitro di cellule dei linfonodi può essere eseguita per analizzare le risposte immunitarie cellulari. I pellet fecali possono essere utilizzati per la valutazione del contenuto proteico e l'analisi dell'espressione genica può essere effettuata mediante analisi QPCR del colon. Infine, l'apice del cieco può essere utilizzato per l'istologia, mentre la restante parte del cieco può essere impiegata per determinare il carico parassitario nei topi infetti.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che indicano se un topo è resistente o suscettibile all'infezione da trais MOUs e che permettono di caratterizzare la risposta immunitaria indotta contro il parassita. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunologia, come quali fattori controllano l'attivazione delle cellule T helper e quali proteine sono necessarie per la differenziazione delle cellule TH2. Le uova di Trauss MOUs possono essere propagate in topi immunodeficienti o in ceppi geneticamente suscettibili, come KR, 35 giorni dopo l'infezione, al fine di raccogliere le uova da topi sottoposti a eutanasia.

Esponi la superficie ventrale dell'animale e sciacqua l'addome del mouse con etanolo utilizzando pinze e forbici sterili. Afferra la pelle addominale ed esegui una piccola incisione. Esponi il contenuto addominale, identifica il ceco e il colon prossimale, quindi rimuovili.

Trasferire gli organi in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente DMEM integrato con penicillina e streptomicina. Quindi aprire il cieco e il colon prossimale con una pinzetta, esponendo la luz e i vermi. Posizionare gli organi aperti in un becher contenente PBS ed agitare delicatamente per rimuovere le feci.

Dopo aver lavato il cieco, trasferirlo in una nuova piastra di Petri e utilizzare pinze curve lisce per estrarre delicatamente i vermi. Trasferire tutti i vermi di ciascun topo in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di DMEM integrato con antibiotici. Posizionare la piastra a sei pozzetti con un tovagliolo di carta inumidito all'interno di un contenitore ermetico e incubare a 37 gradi Celsius per quattro ore, in modo da permettere ai vermi di deporre le uova.

Dopo questo periodo di incubazione, utilizzare pinzette per rimuovere i vermi dal pozzetto originale e suddividerli in due nuovi pozzetti contenenti DMEM. Suddividendo i vermi in questo modo si massimizzerà il recupero delle uova mediante pipetta. Raccogliere il mezzo rimanente contenente l'antigene secreto e le uova dal pozzetto originale e trasferirlo in un tubo Falcon da 15 millilitri.

Centrifugare il tubo a 3000 RPM per cinque minuti. Quindi rimuovere e conservare il soprannatante contenente l'antigene di quattro ore e Reese's bend l'uovo contenente il pellet in acqua sterile. Posizionare la piastra a sei pozzetti contenente i vermi a 37 gradi Celsius ancora una volta e incubare durante la notte; il mattino seguente.

Dopo aver scartato i vermi, raccogliere il contenuto dei pozzetti come mostrato in precedenza e centrifugare il sopranatante per isolare le uova. Conservare il sopranatante contenente l'antigene ottenuto durante l'incubazione notturna e risospendere le uova in acqua. Come in precedenza, combinare queste uova con quelle ottenute dall'incubazione di quattro ore.

Filtrare le uova attraverso un setaccio da 70 micron per rimuovere eventuali vermi residui. Successivamente, trasferirle in un matraccio quadrato da 75 centimetri. Coprire il matraccio con pellicola di alluminio per proteggerlo dalla luce e conservare le uova per sei settimane a temperatura ambiente.

Questo permetterà alle uova di maturare e sviluppare l'embrione dopo sei settimane. Lavare le uova, aggiungere acqua e contare le uova vitali. Come mostrato qui.

Come esempio di un uovo embrionato vitale e di un uovo non vitale, Reese's bend la concentrazione di Exeter a 50 per 50 microlitri. A questo punto, gli uova possono essere conservati a quattro gradi Celsius prima di infettare i topi. Assicurarsi di risospendere accuratamente la soluzione contenente le uova.

Trasferire la quantità desiderata di inocolo in un tubo da 14 millilitri con tappo a vite e capovolgere il tubo per mescolare. Aspirare 200 microlitri di uova in un ago alimentatore di dimensioni adeguate alla taglia dell'animale, collegato a una siringa da un millilitro. Afferrare il topo per la nuca e somministrare le uova mediante gavaggio orale.

Rimettere il topo infetto nella sua gabbia e lasciare che l'infezione proceda per 21 giorni. Dopo 21 giorni, utilizzare una siringa non eparinizzata per prelevare il sangue dei topi infetti mediante puntura cardiaca. Dopo l'eutanasia con anidride carbonica, i campioni di sangue possono essere conservati a quattro gradi Celsius.

Per l'isolamento del siero e l'analisi di IgG e IgE specifiche per tra mediante ELISA. Esporre la cavità addominale del topo come descritto in precedenza. Quindi utilizzare pinzette per estrarre il ceco con forbici o un altro paio di pinzette.

Spostare l'intestino tenue verso destra, esponendo i linfonodi mesenterici. Rimuovere delicatamente i linfonodi avendo cura di non tagliare l'intestino e posizionarli in un tubo Falcon da 15 millilitri contenente due millilitri di mezzo di coltura. Le cellule dei linfonodi possono successivamente essere riattivate *in vitro* con il supernatante dell'antigene S di quattro ore proveniente dalle colture di vermi, al fine di analizzare la risposta immunitaria cellulare al parassita.

Dopo aver prelevato i linfonodi, escindere il ceco e il colon come descritto in precedenza, utilizzando pinze, liberare i pellet fecali dal colon distale, ponendoli in un tubo da due millilitri; i pellet possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius e analizzati per contenuto proteico mediante western blot utilizzando forbici. Tagliare circa un centimetro di colon prossimale e collocarlo in un tubo contenente RNA. Successivamente, conservare a quattro gradi Celsius.

Recidere circa cinque millimetri dalla punta del cieco tenendo la punta del cieco con una pinzetta. Utilizzare una siringa da tre millilitri e un ago da 22 gauge per lavare il campione con PBS. Successivamente, trasferirlo in un tubo da cinque millilitri con tappo a vite contenente paraformaldeide al 4%.

Il campione del cieco fissato con paraformaldeide può essere conservato a quattro gradi Celsius ed utilizzato per l'analisi istologica. Posizionare il resto del cieco in una piastra di Petri e congelarlo a meno 20 gradi Celsius per uccidere i vermi. Per un conteggio più semplice dei vermi, scongelare il cieco e collocarlo in una piastra di Petri contenente circa cinque millilitri di acqua, utilizzando delle forbici.

Tagliare il cieco per esporne la cavità e agitare per raccogliere le feci in una capsula. Posizionare il cieco pulito in una nuova piastra di Petri contenente acqua ed utilizzare pinze curve lisce per raschiare via le cellule epiteliali intestinali. Trasferire il cieco in un'altra piastra di Petri contenente acqua e strappare il tessuto in piccoli pezzi.

Si osservino le feci, le cellule epiteliali intestinali e il tessuto del cieco al microscopio stereoscopico ed si enumerino i vermi, rimuovendoli man mano che vengono contati e posizionandoli in una nuova piastra. Questo è l'aspetto che i vermi nel cieco devono avere prima e dopo l'isolamento, come mostrato qui. I topi tragus, in seguito all'infezione, mostrano una capacità di controllo dei parassiti paragonabile a quella dei topi black six, mentre i topi KR sviluppano carichi parassitari elevati.

Analogamente, i topi A KR suscettibili sviluppano titoli di IgG specifica per TRA significativamente più elevati rispetto ai topi black six, come determinato mediante saggio ELISA su siero. In questo esperimento, l'analisi mediante Western blot ha rivelato che la quantità della proteina specifica delle cellule caliciformi, realm beta, era aumentata nelle feci dei topi black six, ma non nei topi A KR, a seguito dell'infezione. L'analisi istologica del ceco distale mostra un'iperplasia delle cellule caliciformi e una produzione di muco nei topi resistenti TRAs MOUs infettati di ceppo black six, ma non nei topi suscettibili A KR.

Dopo aver visionato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come propagare le uova di trismo, infettare topi sperimentali e raccogliere i tessuti intestinali, il meso, i linfonodi enterici e il sangue per l'analisi dell'infezione in topi suscettibili o resistenti.