Name: Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Scopri un metodo di microscopia a fluorescenza per monitorare la mitofagia nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Questa tecnica utilizza il biosensore Mt Rosea per visualizzare l'accumulo dei mitocondri nel vacuolo.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di ricerca australiano di Grant DP0986937.

Scegliendo opportunamente ceppi di lievito di controllo Il test si basa sulla sperimentatore visivo valutare l'accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo lievito. Come tale, il saggio è soggettiva e si basa sulla selezione di ceppi di controllo adeguate e condizioni di crescita. Un controllo wild-type è usato per indicare i livelli di autofagia normalmente previsto. Come controllo negativo un valore nullo sforzo per l'espressione di uno dei geni del nucleo autofagia (ad esempio, ATG3) è idonea; tali ceppi non in grado di fornire materiale (ad esempio, mitocondri, nucleo) al vacuolo 1. Trasformazione di cellule di lievito con DNA plasmidico Cellule di lievito può essere fatto facilmente competente per la trasformazione trattando con LiAcetate. Kit commerciali possono essere acquistati (ad esempio, EasyComp, Invitrogen) e protocolli pubblicati sono disponibili 13. In questo protocollo usiamo ceppo wild type BY4741 (MAT uno his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0), e alcuni membri di una libreria completa di ceppi mutanti di eliminazione (ad esempio, Δ atg3) che ne derivano, manca ogni espressione di una diversa non essenziali del gene. La biblioteca ceppo cancellazione rappresenta uno strumento prezioso per indagare l'autofagia con Rosella basato sonde. Il giornalista impiegato in questo protocollo è mt-Rosella per mitocondri (Fig. 2A), codificato dal pAS1NB: Rosella mt-12. I passi seguenti sono basate sull'uso di cellule fatte competente utilizzando il kit di trasformazione EasyComp e conservati congelati a -80 ° C per uso conveniente. <ol><li> Equilibrare Solution III (EasyComp trasformazione Kit) a temperatura ambiente 30 minuti prima di aggiungere alle cellule di lievito. </li><li> Aggiungi 2-2,5 microlitri (~ 100 ng / mL) di DNA plasmide che codifica per il reporter (pAS1NB: mt-Rosella) ad una sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga. </li><li> Aggiungere 5 ml di sospensione appena scongelato competente di cellule di lievito e mescolare pipettando gentile. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione III (EasyComp trasformazione Kit) e vortex per miscelare. 1.5) Incubare le reazioni di trasformazione per 1 ora a 28-30 ° C con forte mescolando ogni 15 minuti utilizzando un vortex o manualmente sfogliando il tubo con il dito. </li><li> Trasferire accuratamente l'impasto trasformazione di una singola piastra YMM crescita agar integrato con istidina, metionina e uracile, e delicatamente distribuire le cellule attorno alla superficie di agar con una spatola di vetro sterile. Cellule di lievito sono fragili in questa fase delicata e la gestione può aumentare la resa di trasformanti. </li><li> Incubare le piastre di crescita per 2 a 4 giorni a 28-30 ° C o fino a quando le colonie appaiono circa 2-3 mm di diametro. </li></ol> 2. Confermando l'espressione di Rosella in cellule di lievito Prima di intraprendere esperimenti dettagliata la localizzazione corretta ed efficace espressione di Rosella dovrebbe essere confermata. <ol><li> Utilizzando stuzzicadenti sterile selezionare per ogni singolo ceppo 5 colonie dalla piastra di trasformazione e risospendere le cellule in 50 ml di acqua sterile in separato sterile 1,7 ml tappo a scatto tubo di plastica microcentrifuga. </li><li> Introdurre 10 ml di ogni sospensione cellulare su vetrini separati etichettati microscopio (76 x 26 mm) e coprire la sospensione cellulare con un quadrato coprioggetto (22 x 22 mm). </li><li> Immediatamente esaminare le cellule per l'emissione di fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (per esempio, Olympus Fluoview FV500). Cercare una forte fluorescenza verde e rosso e l'etichettatura tipiche di localizzazione mitocondriale (Fig. 2B e 2C). </li><li> Il resto di ogni colonia esaminato per fluorescenza in questo modo dovrebbe essere inoculato su un piatto fresco crescita YMM. </li><li> Incubare le piastre a 28-30 ° C per 2 giorni fino colonia sono di circa 2-3 mm di diametro. </li></ol> 3. La crescita delle cellule e l'induzione di autofagia Autofagia può essere indotta con una serie di diverse condizioni sperimentali, tra cui l'entrata in fase stazionaria, la trasformazione in fonte di carbonio, la somministrazione di rapamicina, o per fame di azoto. Noi abitualmente uso fame di azoto come metodo per indurre mitophagy. <ol><li> Inoculare una singola colonia in 10 ml di terreno di coltura contenente etanolo e gli integratori auxotrophic appropriato. </li><li> Incubare colture di lieviti a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 giri) per circa 48 ore. Le cellule devono essere a metà del log fase di crescita. </li><li> Cellule pellet da duplicare campioni 1 ml di cultura in tubi di plastica sterile 1,7 ml con tappo a scatto centrifuga per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere con cautela e scartare il sopranatante senza disturbare il pellet. </li><li> Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medium. </li><li> Dopo il terzo lavaggio risospendere le cellule in 100 ml di terreno di coltura o di azoto fame medio. </li><li> Re-inoculare le cellule risospese in 10 ml di terreno di coltura fresco o 10 ml di azoto medio-fame. Incubare con agitazione orbitale per 6-12 ore per consentire l'induzione di mitophagy. Dopo aver fame preparare le cellule per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. </li></ol> Nota: Etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg La prima volta che istituisce il test è utile per confermare la consegna sotto microscopio a fluorescenza di Rosella al vacuolo. Anche se il lievito vacuolo è un organulo di grandi dimensioni la cui ubicazione spesso può essere facilmente valutata in relazione alla trasmissione delle immagini della luce, in alcuni ceppi di lieviti e in alcune condizioni di crescita del vacuolo può essere frammentato e difficile da individuare. Il vacuolo può essere facilmente etichettato con un cumarina a base dye vacuolo come CMAC-Arg (7-ammino-4-chloromethylcoumarin, L-arginina amide). L'azione della proteasi vacuolari sui risultati tintura in blu brillante etichettatura fluorescenza del vacuolo. L'emissione blu possono essere facilmente distinguibili dalle emissioni di rosso e verde di Rosella 11. Etichettatura con CMAC-Arg non ha bisogno di essere eseguita di routine, ma è consigliato per coloro che non hanno familiarità con la posizione e l'aspetto del vacuolo nel lievito. 4. L'etichettatura del vacuolo con CMAC-Arg <ol><li> Aggiungere il CMAC-Arg (100 concentrazione mM finale) di cellule in crescita o azoto fame prima di imaging. Il CMAC-Arg soluzione può essere preparata in anticipo, ma la soluzione è sensibile alla luce ha bisogno di essere protetti dall'esposizione alla luce. </li><li> Incubare a 28-30 ° C con agitazione orbitale (200 rpm) per 30 minuti. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule tre volte con acqua distillata sterile da risospensione seguita da centrifugazione per rimuovere residui di medie e superiori CMAC-Arg colorante. </li><li> Montare le cellule per l'imaging come descritto di seguito. </li></ol> 5. Montaggio cellule di lievito vivo per la microscopia confocale a scansione laser (CLSM) <ol><li> Sciogliete 2 mg di agarosio a basso punto di fusione in separati 1 ml di mezzo di crescita e di azoto fame medio di incubazione a 70 ° C. Il fuso agarosio è mantenuta a 70 ° C. </li><li> Delicatamente il pellet di cellule in 1 ml di ciascuna coltura cellulare per centrifugazione a 2.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. </li><li> Lavare le cellule per tre volte con 1 ml di acqua distillata sterile da risospensione e centrifugazione, come al punto 5.2. </li><li> Risospendere le cellule lavate in 100 ml di acqua distillata sterile. </li><li> Per montare il posto celle 20 l di fuso agarosio su un vetrino da microscopio etichettati di vetro (76 x 26 mm). </li><li> Immediatamente posto 10 ml di sospensione cellulare lavato sul letto di agarosio. </li><li> Coprite il letto di agarosio con un coprioggetto (22 x 22 mm). Le cellule si diffonderà su tutta la superficie agarosio sotto il vetrino. </li><li> Per prevenire la disidratazione e il movimento del coprioggetto durante l'imaging con attenzione sigillare i bordi del coprioggetto con un sottile strato di smalto. </li><li> Quando lo smalto è completamente asciutto (10 min) il vetrino è pronto a vista da Attenzione microscopia a fluorescenza: smalto per unghie può causare danni agli obiettivi microscopio. </li><li> Celle montate con questa tecnica si possono osservare fino a 1 ora dopo il montaggio. </li></ol> 6. Autofagia visualizzare utilizzando CLSM Il livello di autofagia in una popolazione di cellule è regolarmente valutato determinando il numero di cellule che mostrano fluorescenza rossa vacuolare prima e dopo l'induzione di autofagia. Idealmente la progressione della autofagia è monitorato in momenti selezionati a seguito di induzione di autofagia (Fig. 3). Questo è il miglior eseguita da visualizzare attraverso il microscopio binoculare. E 'importante che i controlli corretti sono impiegati (ad esempio, Δ atg3 mutanti) e che le impostazioni microscopio rimangono invariate tra l'osservazione di campioni diversi (ad esempio, l'uso di filtri a densità neutra, selezione del filtro). Cellule di lievito sono relativamente piccole che richiedono un buon microscopio a fluorescenza di qualità (ad esempio, Olympus Fluoview FV500) dotato di eccitazione / emissione di appositi filtri per la visualizzazione separata di GFP e / o pHluorin (emissione di fluorescenza verde) (FITC filtro) e DsRed.T3 (rosso emissione di fluorescenza) (TRITC filtro). <ol><li> Utilizzando un obiettivo 60x vista l'acqua non morire di fame le cellule wild-type utilizzando alternativamente i filtri FITC e TRITC. Cellule wild-type dovrebbe mostrare una distribuzione tipica dei mitocondri cellulari alla periferia delle cellule che mostrano sia la fluorescenza rossa e verde. Si noti che questa distribuzione dei mitocondri dipende dalla Pinhole regolazione del microscopio confocale. Noi di solito utilizzare un valore inferiore a foro stenopeico di 125 micron, che consente solo i mitocondri da osservare come una serie di punti localizzati alla periferia della cellula (Fig. 2C) in modo che il vacuolo non è oscurata 12. Se un valore alto di foro stenopeico (200 micron) viene usato questo permette la tipica rete filamentosa mitocondriale distribuiti in tutta la cella (e le modifiche che subisce), da osservare 11. Nessun altre strutture nella cella deve essere fluorescente. </li><li> Sequenzialmente vista cellule per ciascuno dei punti di tempo dopo il trasferimento a medio fame. Visualizzare alternativamente usando i filtri emissione verde e rosso. Alla fame 6 fluorescenza tempo h punto rosso, ma nessuna emissione corrispondenti verde dovrebbe essere distinguibili nel vacuolo. Localizzazione vacuolare possono essere separatamente confermata usando CMAC-Arg (Fig. 2C). Vista ~ 200 celle e contare il numero che mostrano solo fluorescenza rossa nel vacuolo (assorbimento cioè vacuolare dei mitocondri). </li><li> Conte accumulo vacuolare per tutti i punti tempo di osservazione&gt; 200 celle e poi trama percentuale di cellule che mostrano accumulo vacuolare. </li><li> Esaminare l'autofagia-negativi cellule di controllo che esprimono mt-Rosella prima di morire di fame e di inedia dopo 6 ore. </li></ol> 7. Rappresentante dei risultati: Qui vi mostriamo i risultati tipici ottenuti con mt-Rosella, espresso in wild-type e Δatg3 cellule mutanti. In condizioni di crescita con l'etanolo come fonte di carbonio, sia di tipo selvatico e Δatg3 cellule mutanti mostrano una distribuzione cellulare di fluorescenza (rosso e verde) tipico dei mitocondri nelle cellule di lievito. Rosso e verde emissione di fluorescenza non viene rilevata nel vacuolo (Fig. 2B e 2C). Quando sono sottoposti a fame di azoto per 6 ore e poi di là, oltre a fluorescenza rossa e verde corrispondente ai mitocondri, le cellule di tipo selvatico mostrano anche l'accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde nel lume vacuolare (Fig. 2B;. Fig. 3) . Tuttavia, in Δatg3 cellule mutanti fluorescenza né rosso né verde si accumula nel lume vacuolare (Fig. 2C;. Fig. 3). <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Top, schema di organelli e compartimenti in una cellula di lievito. In basso, un vacuolo-centric vista di una cellula di lievito è presentato indicando il degrado autofagici di organelli diversi scomparti. Alcune delle differenze tra i vari organelli specifici tipi di autofagia (ad esempio, mitophagy, nucleophagy) includono la specificità (selezione carico) dei contenuti inghiottito, varie esigenze intracellulari e segnali extracellulari (ad esempio, la fame, danni), segnali specifici, ATG geni e la dipendenza del tempo. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2a.jpg" alt="Figura 2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2a"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2b.jpg" alt="Figura 2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2b"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2c.jpg" alt="Figura 2c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2c"> <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig2d.jpg" alt="Figura 2d" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2d"> Figura 2. (A) Rappresentazione schematica di mt-Rosella. La sequenza capo mitocondriale (in questo caso di citrato sintasi) è utilizzato per indirizzare il biosensore Rosella alla matrice mitocondriale. Eccitazione ed emissione massimi per entrambi proteina fluorescente rossa (DsRed.T3) e proteina fluorescente verde (pHluorin) sono indicati. A pH elevato (mitocondriale pH ~ 8.2) il biosensore fluorescente rosse e verdi, invece, a basso pH (pH vacuolare ~ 5,5) è solo rosso fluorescente. (B) Rappresentazione schematica dei risultati attesi nel wild-type e Δ atg3 cellule mutanti che esprimono mt-Rosella. (C) I risultati effettivi ottenuti CLSM per le cellule di tipo selvatico in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra:. DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono (D) I risultati effettivi ottenuti al microscopio a fluorescenza per Datg3 cellule mutanti sotto in crescita e le condizioni di fame di azoto. Da sinistra a destra: DIC (differenza di contrasto), RFP (DsRed.T3) emissione di fluorescenza, GFP (pHluorin) emissione di fluorescenza, CMAC-Arg fluorescenza e immagine si fondono. <img src="/files/ftp_upload/2779/2779fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. La percentuale di wild-type e Δ atg3 cellule mutanti, esprimendo mt-Rosella e cresciuti sotto la fame di azoto, che mostra fluorescenza rossa nel vacuolo per un durata di 48 ore. La percentuale di cellule che mostrano accumulo di fluorescenza rossa nel vacuolo è stato registrato a 0, 6, 12, 24 e 48 ore dopo l'inizio fame di azoto.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nelle immagini rappresentative presentato in fig. 2B e 2C si può chiaramente vedere che l&#39;uso di reporter fluorescenti organelli specifici e microscopia a fluorescenza fornisce la prova di localizzazione mitocondriale / distribuzione sia in crescita e di azoto a corto di cellule, e permette mitophagy da visualizzare. E &#39;da sottolineare che questo metodo non si limita a mitophagy seguente. Autofagia di altri componenti cellulari o organelli (ad esempio, i ribosomi, gocce lipidiche, perossisomi, reticolo endoplasmatico e nucleo) possono essere monitorati con un&#39;adeguata etichettatura. Dettagli del costrutto biosensore Rosella, condizioni di coltura cellulare e risultati tipici per il fatturato del nucleo (nucleophagy) sono stati segnalati 11,12 illustrano la più ampia applicazione del metodo. L&#39;uso di giornalisti fluorescenti organello specifico per l&#39;autofagia monitoraggio richiede diverse considerazioni di design costruire da tenere in mente. Questi includono: (1) la selezione e la fusione al segnale appropriato targeting per raggiungere organello-specifici mirati, (2) selezione di una proteina fluorescente adatto (s), (3) forte emissione di fluorescenza, (4) corretta localizzazione degli organelli e / o distribuzione all&#39;interno della cellula. Una volta che l&#39;organello specifico giornalista è stata espressa con successo nel paese ospitante ceppo di lievito selezionato un secondo gruppo di considerazioni diventano: (1) le condizioni di crescita del lievito, (2) preparazione dei campioni di cellule, (3) i parametri di imaging, come è importante che i parametri selezionati per CLSM (ad esempio, l&#39;intensità del laser, frequenza e la modalità, il valore foro stenopeico, valore di zoom, obiettivi utilizzati o di esposizione per i CCD-camera) sono mantenuti per tutto un esperimento garantire che possano essere effettuati raffronti tra il controllo (cellule in crescita) e di campioni affamati; ( 3) induzione autofagia e di successo la consegna del giornalista nel vacuolo. In generale, questo metodo di microscopia a fluorescenza è facile, relativamente veloce, e ha potenziale applicazione per lo screening ad alto rendimento per i nuovi farmaci che migliorano o inibire l&#39;autofagia, e anche per i geni che regolano o modulano l&#39;autofagia.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Saccharomyces cerevisiae EasyComp Kit di trasformazione </td><td> Invitrogen </td><td> K5050-01 </td></tr><tr><td> Lievito di base di azoto, senza aminoacidi e solfato di ammonio </td><td> BD Difco </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Basso punto di fusione agarosio </td><td> Progen Biosciences </td><td> 200-0030 </td></tr><tr><td> Vetrini da microscopio (76 x 26 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto microscopio (22 x 22 mm) </td><td> Menzel-Glaser </td><td> BB022022A1 </td></tr><tr><td> Microscopio confocale a scansione laser Fluoview FV500 </td><td> Olimpo </td><td></td></tr><tr><td> CMAC-Arg </td><td> Moleular Sonde-Invitrogen </td><td> Y-7531 </td></tr></tbody></table> Tutte le concentrazioni sono dato w / v, salvo diversa indicazione. Lievito terreno minimo (YMM): 0,67% di base di azoto, senza lievito aminoacidi, glucosio al 2%, 1,5% agar (aggiunto solo quando si effettua mezzi solidi) e eventuali supplementi richiesti auxotrophic (0,01%)]. Sali cerevisiae (SS): (NH 4) 2 S0 4, 0,12%; KH 2 PO 4, 0,10%; MgC1 2 .6 H2O, 0,07%; NaC1, 0,05%; CaCl2, 0,01%; FeC1 3, 0,0005%. Crescita media: SS e 2% di etanolo (v / v) e integratori auxotrophic appropriato. Azoto fame medio: 0,17% di base di azoto, senza lievito aminoacidi e solfato di ammonio (Difco), 2% di etanolo (v / v).

un saggio microscopia a fluorescenza per mitophagy monitoraggio nel lievito saccharomyces cerevisiae

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

L&#39;autofagia è importante per un fatturato di componenti cellulari sotto una serie di condizioni diverse. Serve una funzione essenziale omeostatica, nonché un meccanismo di controllo di qualità che può avere come bersaglio e di degradare selettivamente materiale cellulare tra cui organelles1-4. Per esempio, danneggiati o ridondanti mitocondri (Fig. 1), non smaltiti mediante autofagia, può rappresentare una minaccia per l&#39;omeostasi cellulare e la sopravvivenza cellulare. Nel lievito, Saccharomyces cerevisiae, la privazione di nutrienti (ad esempio, la fame di azoto) o danni possono promuovere fatturato selettiva dei mitocondri da autofagia in un processo chiamato mitophagy 5-9. Descriviamo un approccio semplice microscopio a fluorescenza per valutare l&#39;autofagia. Per maggiore chiarezza limitiamo la nostra descrizione qui per mostrare come l&#39;approccio può essere utilizzato per monitorare mitophagy in cellule di lievito. Il saggio si avvale di un reporter fluorescente, Rosella, che è un dual-emissioni biosensore che comprende un pH relativamente stabile proteina fluorescente rossa legata ad una sensibile al pH proteina verde fluorescente. Il funzionamento di questo giornalista si basa sulle differenze di pH tra i (pH ~ 5,0-5,5) e vacuolo mitocondri (pH ~ 8.2) nelle cellule viventi. In condizioni di crescita, le cellule di tipo selvatico presentano sia fluorescenza rossa e verde, distribuito in una caratteristica forma dei mitocondri. Emissione di fluorescenza non è associato con il vacuolo. Quando sono sottoposti a fame di azoto, una condizione che induce mitophagy, oltre a fluorescenza rossa e verde etichettatura dei mitocondri, le cellule mostrano l&#39;accumulo di rosso, ma non fluorescenza verde, nel lume acido vacuolare che rappresenta la consegna dei mitocondri al vacuolo. Segnando le cellule con il rosso, ma vacuoli fluorescente verde non può essere utilizzata come una misura di attività mitophagic nelle cellule 5,10-12.

Un valido approccio per monitorare la fornitura dei organelli al lume acida del vacuolo lievito per il degrado e il riciclaggio è descritto. Il metodo si basa sulla etichettatura specifica di organelli bersaglio geneticamente codificato con un dual-emissione di fluorescenza pH biosensore, e la visualizzazione delle singole cellule mediante microscopia a fluorescenza.

Un saggio microscopia a fluorescenza per Mitophagy monitoraggio nel lievito Saccharomyces cerevisiae

L'autofagia è fondamentale per il turnover dei componenti cellulari in diverse condizioni. Svolge una funzione omeostatica essenziale cũng come...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è seguire l'assorbimento dei mitocondri nel vae come mezzo per studiare l'autofagia dei mitocondri, un processo noto come mitofagia. Questo viene ottenuto esprimendo nelle cellule di lievito un biosensore fluorescente genetico e mirato ai mitocondri con doppia emissione, chiamato Mt Rosea, che etichetta i mitocondri con fluorescenza rossa e verde. Come secondo passaggio, le cellule di lievito vengono sottoposte a carenza di azoto per indurre l'autofagia.Successivamente, osserviamo le cellule mediante microscopia a fluorescenza o microscopia confocale a scansione laser al fine di visualizzare l'assorbimento dei mitocondri all'interno delle VAs. I risultati ottenuti mostrano un accumulo di fluorescenza rossa, ma non verde, nelle VAs di cellule sottoposte a carenza di azoto. Tale evidenza, insieme al punteggio di autofagia assegnato alle cellule in una popolazione, permette di determinare il grado di mitofagia.Utilizzando rosea per monitorare l'assorbimento dei mitocondri all'interno della vacuolo delle cellule di lievito, è possibile ottenere informazioni meccanicistiche sul processo di mii. L'approccio può essere adattato per monitorare l'autofagia di altri compartimenti cellulari, come il nucleo, dimostrando che la procedura sarà eseguita da Dalibor Alica, ricercatore postdottorato del nostro laboratorio. In questo protocollo utilizziamo un ceppo di tipo selvatico BY 4 7 41 e un ceppo mutante di delezione delta A TG three, derivato dallo stesso background genetico, per visualizzare la localizzazione dei mitocondri.In questi ceppi, essi sono marcati con un reporter fluorescente. Rosea Rosea è un biosensore a emissione di due colori costituito da una proteina fluorescente rossa relativamente stabile al pH e da una proteina fluorescente verde sensibile al pH. La sequenza bersaglio mitocondriale viene utilizzata per indirizzare il biosensore Rosea alla matrice mitocondriale.Questo reporter è stato denominato Mt.Rosea; a pH elevato il biosensore emette fluorescenza rossa e verde, mentre a pH basso emette solo fluorescenza rossa. Il ceppo di tipo selvatico funge da controllo per indicare i livelli di autofagia normalmente attesi, utilizzato come controllo negativo.È adatto un ceppo privo dell'espressione di un gene essenziale per l'autofagia. Poiché un tale ceppo non può trasportare i mitocondri nella vacuolo, si utilizzano procedure standard per trasformare i ceppi di lievito con il plasmide portante il reporter rosala mirato ai mitocondri; le piastre di crescita vengono incubate da due a quattro giorni a 28-30 gradi Celsius fino alla comparsa di colonie di circa due-tre millimetri di diametro. Per coltivare le cellule per l'induzione dell'autofagia, inoculare per ciascun ceppo una singola colonia di lievito in 10 millilitri di mezzo di crescita contenente una fonte di carbonio non fermentabile.In questo caso, etanolo e i corrispondenti integratori ossidativi. Vengono coltivate colture duplicate per ogni ceppo, per un totale di quattro colture. Incubare le colture di lievito per circa 48 ore a 28-30 gradi Celsius con agitazione orbitale, fino a quando le colture dovrebbero trovarsi nella fase logaritmica media di crescita.Al termine del periodo di incubazione, trasferire due campioni di un millilitro di ogni coltura in provette di centrifugazione in plastica con tappo a scatto da 1,7 millilitri. Pellettare delicatamente le cellule mediante centrifugazione a bassa velocità. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione e scartare il sopranatante da ciascuna provetta senza disturbare il pellet cellulare.Lavare le cellule con un millilitro di acqua distillata sterile mediante risospensione, seguita da centrifugazione. Ripetere il lavaggio altre due volte per rimuovere il mezzo residuo. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 100 microlitri di mezzo di crescita o in condizioni di carenza di azoto.Il mezzo di carenza di azoto contiene la fonte di carbonio etanolo, ma non comprende integratori di azoto e indurrà l'autofagia nelle cellule. Successivamente, reinoculare le cellule sospese in 10 millilitri di mezzo di crescita fresco oppure in 10 millilitri di mezzo di carenza di azoto.Incubare le colture con agitazione orbitale per sei-dodici ore dopo l'induzione dell'autofagia. È utile confermare il rilascio di Mt Rosea nei vae mediante microscopio a fluorescenza. I vae possono essere individuati mediante etichettatura con un colorante fluorescente blu a base di cumarina, come il sette amino quattro cloro metil cumarina, L arginina mi cmac arg in forma abbreviata.L'etichettatura con cmac ARG non deve essere eseguita in via routinaria, ma è consigliata per chi non è familiare con la posizione e l'aspetto della vacuolo nei lieviti. Per iniziare la procedura di etichettatura del vacuolo, trasferire campioni di un millilitro di ciascuna coltura in provette di centrifuga di plastica da 1,7 millilitri con tappo a scatto separate. Quindi aggiungere cmac arg a ciascuna provetta.Incubare i tubi a 28-30 gradi Celsius con agitazione orbitale per 30 minuti. Dopo 30 minuti, raccogliere le cellule mediante centrifugazione, eliminare il soprannatante e lavare le cellule con un millilitro di acqua distillata sterile mediante sospensione, seguito da centrifugazione. Lavare le cellule altre due volte con acqua distillata sterile.Questo passaggio rimuove il mezzo residuo e l'eccesso di cmac arg die. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in 100 microlitri di acqua distillata sterile. Le cellule sono ora pronte per essere montate e analizzate mediante microscopia a fluorescenza.Quando si esegue questo protocollo, è molto importante utilizzare colture di lievito appena trasformate per assicurarsi di ottenere cellule T con mitocondri altamente fluorescenti. Per preparare cellule di lievito vive da osservare mediante microscopia a fluorescenza, sciogliere due milligrammi di agarosio a basso punto di fusione in aliquote separate da un millilitro di mezzo di crescita e di mezzo di privazione di azoto, incubando a 70 gradi Celsius per un'ora; l'agarosio fuso viene mantenuto a 70 gradi Celsius. Per montare le cellule, depositare 20 microlitri di agarosio fuso su un vetrino microscopico di dimensioni 76 per 26 millimetri etichettato.Fare scivolare immediatamente 10 microlitri della sospensione cellulare lavata sul letto di aros. Coprire il letto di aros con un coprioggetto di vetro di 22 per 22 millimetri. Le cellule si diffonderanno sulla superficie di agros al di sotto del coprioggetto.Quindi sigillare con cura i bordi del vetrino coprioggetto con un sottile strato di smalto per unghie. Questo impedirà la disidratazione e lo spostamento del vetrino coprioggetto durante l'acquisizione delle immagini. Una volta che lo smalto per unghie è completamente asciutto, i preparati sono pronti per essere osservati al microscopio a fluorescenza. Le cellule montate possono essere osservate fino a un'ora dopo il montaggio senza alcun effetto avverso apparente sulle cellule.Essendo le cellule di lievito relativamente piccole, sarà necessario un microscopio a fluorescenza di buona qualità dotato di filtri di eccitazione ed emissione adatti per la visualizzazione separata dell'emissione di GFP e di RFP, nonché di un obiettivo a immersione in acqua 60x con un'apertura numerica di 1,2. Qui vengono mostrati risultati tipici ottenuti utilizzando MT Rosea espressa in cellule di tipo selvatico mediante microscopia confocale a scansione laser. I risultati sono stati ottenuti in condizioni non di carestia, con etanolo come fonte di carbonio, mentre le cellule di tipo selvatico mostrano una distribuzione cellulare tipica dei mitocondri in periferia nelle cellule di lievito, che presentano fluorescenza sia rossa che verde.Non viene rilevata emissione di fluorescenza rossa e verde nella vacuola. Quando cellule selvatiche esprimenti MT.Rosea sono sottoposte a carenza di azoto per sei ore e oltre, mostrano, oltre alla fluorescenza rossa e verde corrispondente ai mitocondri, l'accumulo di fluorescenza rossa, ma non verde, nel va.Questo segnale mitocondriale è indicativo di autofagia. L'assunzione autofagica dei mitocondri è ulteriore. La localizzazione di rosea può essere confermata separatamente utilizzando CMAC arg.Al contrario, le cellule di controllo negative per la mitofagia che esprimono MT.Rosea, osservate prima della privazione nutrizionale e dopo sei ore o più di digiuno, non mostrano alcun accumulo di fluorescenza rossa nella vacuolo. Mentre l'etichettatura mitocondriale rimane intensa per valutare il livello di autofagia nei ceppi di tipo selvaggio e nei mutanti A TG tre, sono state osservate più di 200 cellule per ceppo per rilevare l'accumulo di fluorescenza rossa nell'ole prima dell'induzione dell'autofagia e in punti temporali selezionati dopo l'induzione. Riportando in grafico la proporzione di cellule che mostrano accumulo ular, si osserva che il grado di uptake ular aumenta nel tempo nelle cellule di tipo selvaggio, ma non nelle cellule mutanti delta ATG tre, che non sono in grado di trasportare i mitocondri nel vacuolo dopo il loro sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori del campo dell'autofagia per esplorare il trasporto di mitocondri e altri organelli, come il nucleo, al VA e le diverse condizioni di crescita in queste cellule.

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