PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la presenza o l'assenza di un pannello di sequenze specifiche di acidi nucleici precedentemente amplificate in una reazione di PCR multiplex. Questo viene ottenuto fissando innanzitutto sonde di DNA marcate con ammina a una membrana di nylon riutilizzabile. I prodotti della PCR marcati con biotina vengono quindi ibridati con le sonde legate alla membrana e strep TTR in perossidasi.

Il coniugato viene aggiunto ai prodotti PCR legati. Successivamente, i prodotti PCR legati vengono rilevati aggiungendo reagenti di rilevamento chemiluminescenti ed esponendo la membrana a una pellicola radiografica ad alta sensibilità. Infine, la membrana viene lavata per rimuovere i prodotti PCR ibridati, consentendo il suo riutilizzo in saggi futuri.

In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano l'ibridazione dei prodotti PCR con le sonde legate alla membrana, visibili sulla pellicola radiografica. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR multiplex, l'elettroforesi su gel, la PCR in tempo reale o il microarray, sono l'elevata capacità di analisi, la relativa rapidità, l'assenza di necessità di attrezzature specializzate e, soprattutto, il basso costo. Prima di iniziare, preparare le seguenti soluzioni seguendo la parte scritta di questo protocollo.

Per preparare la membrana, preriscaldare il forno a 60 gradi Celsius. Pulire il mini blotter con etanolo al 70%, diluire le sonde di oligonucleotidi in bicarbonato di sodio 0,5 molar a una concentrazione finale di due picomoli per microlitro e un volume di 200 microlitri. Tagliare la membrana di nylon a 15 per 15 centimetri, utilizzando una matita e un righello per delimitare uno spazio di 0,5 centimetri lungo il bordo superiore della membrana, e scrivere in tale zona i dettagli dell'esperimento.

Sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con 20 millilitri di soluzione di EDAC al 16% appena preparata e agitare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare la membrana con acqua deionizzata per 30 secondi. Successivamente, posizionare la membrana in un mini blotter con canali disposti trasversalmente rispetto alla membrana.

Quindi posizionare il cuscino di supporto e chiudere il blotter. Aspirare accuratamente qualsiasi liquido dai canali. Riempire le corsie 1 e 45 con 150 microlitri di bicarbonato di sodio 0,5 molare.

Utilizzare 150 microlitri di ciascuna soluzione sonda per riempire in sequenza le corsie da 2 a 44, avendo cura di evitare bolle d'aria. Se dovesse apparire una bolla d'aria nel canale, mantenere la pipetta in posizione ed aspirare rapidamente la soluzione in modo che la bolla d'aria risalga in cima alla punta della pipetta, quindi riprovare. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti.

Aspirare le soluzioni della sonda. Rimuovere la membrana e lavarla in 250 millilitri di idrossido di sodio 0,1 molare a temperatura ambiente per nove minuti. Lavare la membrana in 250 millilitri di SSPE 2X per 30 secondi.

Quindi lavarlo in 250 millilitri di SSPE 2× pre-riscaldato con 0,1% SDS in forno a 60 gradi Celsius per cinque minuti, se non si utilizza immediatamente per ibridazione. Lavare la membrana in 240 millilitri di EDTA 20 millimolare a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con i rimanenti 10 millilitri di EDTA 20 millimolare e conservare a quattro gradi Celsius.

Infine, lavare il mini blosser con detergente per collo pirite e una spazzola, risciacquare e lasciare asciugare in multiplex. L'amplificazione mediante PCR delle sequenze di interesse non è descritta in questa dimostrazione, ma deve essere eseguita prima dell'ibridazione. Prima di iniziare la procedura di ibridazione, preparare le seguenti soluzioni secondo la parte scritta di questo protocollo.

Accendere un forno e impostarlo a 60 gradi Celsius e un altro forno a 42 gradi Celsius. Portare l'acqua a ebollizione in un becher grande su un piastra riscaldante. Pulire il mini blotter con etanolo al 70%.

Successivamente, prelevare un'aliquote di 10 millilitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS in un contenitore piccolo. Poi aggiungere 20 microlitri di ciascun prodotto PCR a 150 microlitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS in provette numerate. Portare a ebollizione i prodotti PCR per 10 minuti a 100 gradi Celsius utilizzando supporti in polistirolo, quindi porre immediatamente in ghiaccio per almeno cinque minuti.

Lavare la membrana nei rimanenti 240 millilitri di SSPE 2x con 0,1% di SDS nel forno a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Posizionare la membrana nel mini blotter con il cuscinetto di supporto. Orientarla in modo che i canali siano disposti verticalmente.

Aspirare il liquido in eccesso dai canali del mini blotter. Aggiungere i restanti 150 microlitri di SSPE 2 volte con 0,1% SDS ai canali primo e ultimo. Aggiungere i prodotti PCR bolliti nei canali da 2 a 44 in sequenza, avendo cura di evitare bolle d'aria.

Posizionare il mini blotter in piano nel forno a 60 gradi Celsius per un'ora per consentire l'ibridazione. Spruzzare il liquido da ogni canale. Quindi rimuovere la membrana dal mini blotter.

Lavare due volte in 250 millilitri di SSPE 2 volte, 0.5% SDS nel forno a 60 gradi Celsius per 10 minuti. Inumidire il supporto in nylon con SSPE 2 volte, 0.5% SDS a 42 gradi Celsius ed utilizzarlo per arrotolare la membrana. Posizionare la membrana arrotolata in un tubo rotante ed eseguire la rotazione per assicurare che la membrana aderisca alla superficie interna.

Aggiungere tre microlitri di strept AD in coniugato con perossidasi a 15 millilitri di SSPE due volte, 0,5% SDS a 42 gradi Celsius e aggiungere al tubo. Chiudere saldamente il coperchio e incubare nel forno rotante a 42 gradi Celsius per 60 minuti. Assicurarsi che il senso di rotazione sia tale per cui la membrana non si tenda.

Controllare periodicamente la presenza di perdite. Lavare il mini blotter con detergente per vetreria e risciacquare con acqua, quindi lasciarlo asciugare. Rimuovere la membrana dal tubo del rullo e lavarla due volte nel resto della soluzione SSPE 0,5% SDS a 42 gradi Celsius per 10 minuti.

Quindi lavare due volte in SSPE 2x a temperatura ambiente per cinque minuti. Impostare entrambi i forni a 80 gradi Celsius e posizionare 500 millilitri di SDS 1% in un forno per preriscaldare. Preparare la soluzione ECL e incubare la membrana nella soluzione di rilevamento ECL per due minuti.

Quindi esporre la membrana al film e sviluppare. Ripetere l'esposizione con tempi più lunghi o più brevi se necessario per rigenerare la membrana. Lavare con 250 millilitri di SDS 1% a 80 gradi Celsius per 30 minuti, due volte.

Quindi lavare con 240 millilitri di EDTA 20 millimolare a temperatura ambiente per 15 minuti. Sigillare la membrana in un sacchetto di plastica con 10 millilitri di EDTA 20 millimolare e conservare in frigorifero a quattro gradi Celsius per un successivo riutilizzo. Questa figura mostra i risultati di un saggio di ibridazione multiplex PCR con blot inverso su linea. I campioni da uno a sei rappresentano controlli positivi tra loro.

È presente almeno un segnale positivo per ciascuno dei 43 sonde. Ogni sequenza bersaglio da A a U viene rilevata mediante due sonde diverse per massimizzare la specificità delle sonde. Una sonda uno e una sonda due rappresentano sonde specifiche per specie, che si prevede risultino positive per ogni campione e che aiutano a orientare la sonda su pellicola.

Un uno è ripetuto nella parte inferiore della membrana. I campioni sette e otto sono controlli negativi. Si noti che le sonde Q1, Q2, T uno e T due mostrano segnale nei controlli negativi, indicando un probabile legame non specifico degli inneschi o la formazione di dimeri di innesco.

Sarebbe necessaria una riprogettazione dei prodotti di queste sonde o primer, poiché le sonde C1, D1 e F1 mostrano strisce lungo la membrana, probabilmente a causa di un certo assorbimento non specifico della streptavidina perossidasi coniugata o del substrato chemiluminescente. Tuttavia, questo fenomeno è facilmente distinguibile dai segnali veri e propri delle sonde positive. Le sonde D1 e D2 presentano segnali relativamente deboli rispetto alle altre sonde.

Questo potrebbe essere dovuto al fatto che ampliconi più grandi portano a un'amplicificazione meno efficiente. Infine, la sonda J due risulta negativa in diversi campioni in cui la sonda J uno è positiva. Ciò molto probabilmente rappresenta una mutazione nel sito di legame di J due per questi campioni.

Una volta padroneggiata questa tecnica, dall'estrazione del DNA fino all'ibridazione PCR Pro, all'interpretazione dei risultati e alla rigenerazione della membrana, tutto può essere completato in meno di 10 ore.