Name: Generazione e letichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Impara a etichettare cellule dendritiche murine derivate dal midollo osseo con nanocristalli Qdot per studi di imaging. Questo metodo consente di tracciare la migrazione cellulare in vivo con microscopia a fluorescenza.

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Questo lavoro sostenuto in parte dal NIH sotto Grant CA137499 R15-01 (PC) e un fondo di avvio da Ohio State University (FB).

1. Dissezione di femori e tibie del mouse e della cultura di cellule del midollo osseo <ol><li> Sacrificio 2 topi da CO 2 asfissia e con attenzione sezionare tibie e femori senza tagliare le estremità delle ossa. </li><li> Pulire le ossa da tutti i tessuti attaccati utilizzando carta velina. Fare attenzione a non rompere le ossa. </li><li> Sterilizzare le ossa per immersione in etanolo al 70% per 10 minuti in una capsula di Petri 35 millimetri. Da questo momento, il lavoro all'interno di una cappa di biosicurezza per evitare la contaminazione delle colture cellulari. </li><li> Recuperare le ossa dal etanolo e lasciarli asciugare per 5 minuti in una capsula di Petri all'interno del cabinet biosicurezza. </li><li> Tagliare i femori a metà, e la tibia con la sua punta più sottile. Infondere la parte interna dell'osso con 1 ml di terreno RPMI (senza siero ma con antibiotici) utilizzando una siringa sterile in una piastra di Petri sterile. </li><li> La sospensione cellulare viene raccolto e lavato 2X in RPMI medio di 10 min centrifugazione in una provetta da 15 ml per centrifuga a 1.100 RPM in una centrifuga refrigerata (4 ° C) con un rotore oscillante. </li><li> Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in 2 ml di tampone di lisi ACK e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente per eliminare i globuli rossi. </li><li> Aggiungere 13 ml di RPMI con 10% FBS, risospendere e lavare 2X in questo mezzo con le stesse impostazioni, come descritto in 1.6. </li><li> Contare le celle, regolare a 2 x 10 5 cellule / ml con RPMI 10% FBS, e aggiungere rm-GM-CSF (20 ng / ml concentrazione finale) 5. </li><li> Aggiungere 10 ml di questa sospensione ad una sterile, qualità microbiologica, 10 centimetri piatto di Petri, e la cultura in un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Tre giorni dopo, aggiungere altri 10 ml di RPMI 10% FBS con 20 ng / l di rmGM-CSF a ciascuno dei piatti preparati. </li><li> Tre giorni dopo, 10 ml di sospensione cellulare vengono recuperati da ciascuna piastra di Petri, centrifugato come in 1.6, risospeso nello stesso volume di RPMI 10% FBS con rmGM-CSF e restituito alla piastra Petri. Le cellule sono coltivate per 2 giorni aggiuntivi in CO 2 incubatore. </li></ol> 2. La raccolta e l'etichettatura dei PVS <ol><li> Dopo 8 giorni di coltura le cellule debolmente aderenti sono recuperati dal lavare i piatti di Petri con terreno fresco. Questo protocollo rende circa 2-4 x10 8 DC nelle nostre mani. Le celle possono essere analizzati per fenotipo DC mediante citometria di flusso. </li><li> Cellule raccolte vengono poi etichettati con il kit 655 celle Qtracker Etichettatura rigorosamente seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Abbiamo ottenuto ottimi risultati etichettatura derivate dal midollo osseo murino DC con Qdots ad una concentrazione 10 nM. Per fare questo, aliquote di componenti Etichettatura Qtracker cellulare Kit A e B sono mescolati in volumi uguali, incubate per 5 minuti a temperatura ambiente, e subito diluito 1 / 100 in un mezzo fresco con vortex per 30 s. </li><li> A macchia 5 x 10 6 DC, mescolare 5 ml di ciascuno i componenti del kit A e B in una provetta Eppendorf e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 1 ml di incubare RPMI 10% FBS, e vortex per 30 secondi. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di sospensione cellulare contenente 5 x10 6 DC, e incubare a 37 ° C per 60 min. </li><li> Poi, lavare le cellule 2X in RPMI 10% FBS (1.100 rpm). Le celle possono essere risospese in RPMI per la cultura più o in PBS per l'iniezione nei topi sperimentali. </li></ol> 3. Valutazione della DC etichettati <ol><li> L'etichettatura delle cellule possono essere valutati mediante microscopia a fluorescenza. Per fare questo, una goccia di sospensione cellulare viene aggiunto a un vetrino da microscopio, coperta con un coprioggetto di vetro, e valutata con un microscopio a fluorescenza tenendo conto che questi Qdots hanno spettri di emissione e di eccitazione di 565 nm e 405-525nm, rispettivamente (Fig. 3 ) </li><li> A questo punto, le cellule etichettate può essere usata per iniettare gli animali, o la maturazione può essere indotta da incubando queste cellule per 48 ore (37 ° C, 5 CO 2) in presenza di LPS (100 ng / ml) e TNF-( 20 ng / ml). Fluorescente etichettatura non è influenzato dalla maturazione DC (Fig. 4). </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Con la presente abbiamo descritto come preparare derivate dal midollo osseo murino DC e come li etichettati con Qdots fluorescenti. Fig. 1 riassume la procedura per ottenere le cellule, mentre la fig. 2 mostra la procedura di etichettarli con Qdots. Come mostrato in fig. 3, quasi tutte le cellule sono etichettati da questa procedura, e questo non è influenzato dalla maturazione DC con fattori infiammatori (Fig. 4). Fig. 5 mostra che Qdot macchiato di DC (Fig.5a) si comportano simili a cellule non colorate quando vengono trattati con un cocktail infiammatorio. Entrambe le preparazioni cellulari similmente upregulate espressione delle molecole co-stimolatorie (Fig. 5b), e producono quantità simili di IL-6 (fig. 5c) e l'ossido nitrico (Fig. 5d) sugli stimoli maturazione. Questo concorda con preceOU dati pubblicati indicano che Qdot colorazione non influisce sulla capacità di DC di trasformarsi in cellule mature capaci di suscitare risposte immunitarie [6]. Queste cellule possono quindi essere utilizzati per l'iniezione animali da esperimento. Come mostrato in fig. 6, 2 giorni dopo l'iniezione endovenosa di DC etichettati in topi, siamo stati in grado di rilevare Qdot macchiato di cellule nella milza. Questo è anche in accordo con precedenti dati pubblicati mostrano l'utilizzo di nanocristalli Qdot per valutare la migrazione delle DC in vivo [6] di imaging non invasiva e di citometria a flusso. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso della generazione di corrente continua dal midollo osseo. Con la presente si raffigurano il processo per ottenere dal midollo osseo DC. Entrambe le tibie e femori sono sezionati e puliti dal tessuto circostante. Suggerimenti ossa sono conservate e l'interno delle ossa sono lavata con media. Dopo aver eliminato i globuli rossi, le cellule del midollo osseo sono coltivate per 8 giorni in presenza di GM-CSF per differenziarle in PVS. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagramma di flusso della procedura di etichettatura. Aliquote uguali di componenti Etichettatura Qtracker cellulare Kit A e B sono mescolati in un tubo eppendorf. Le cellule dendritiche sono raccolti da culture osso di 8 giorni midollo con GM-CSF e miscelato con la tintura di etichettatura per 60 minuti a 37 ° C. Quindi le cellule vengono lavate in media per eliminare le particelle di etichettatura in eccesso. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Microfotografia fluorescente di DC subito dopo l'etichettatura. Una goccia di cellule marcate è stato depositato su un vetrino e coperta da un coprioggetto. Poi, i campioni sono stati valutati in un microscopio a fluorescenza e le immagini sono state acquisite attraverso un 5,0 Colore Micropublisher fotocamera digitale CCD (Qimaging, Surrey, BC Canada). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Microfotografia fluorescente di DC dopo 48 ore di maturazione in vitro. DC etichettati sono state coltivate per 48 ore con LPS (100 ng / ml) e TNF-α (20 ng / ml) su vetrini su un incubatore CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Poi, i campioni sono stati lavati con PBS (5 min, 2X), fissate con acetone (15, min 4 ° C) e di contrasto con DAPI. Le cellule sono state valutate in un microscopio a fluorescenza come sopra. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. L'attività biologica del Qdot DC macchiato maturo. DC etichettati maturato in vitro di cui sopra sono stati analizzati mediante citometria di flusso (A) e (B). (A) Qdot macchiato di cellule dare un segnale forte nella (PerCP) canale FL3. Ombreggiato istogramma: controllo senza macchia. (B) DC Qdot macchiato e senza macchia sono stati ulteriormente colorate con anticorpi specifici contro la maturazione marker CD86 e CD40, e controlli isotipo. Le cellule sono state poi analizzate in un citofluorimetro FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). Inoltre, IL-6 (C) e l'ossido nitrico (NO) sono stati determinati in surnatanti di maturità Qdot macchiati di DC e controlli. I livelli di IL-6 e l'ossido di azoto sono stati determinati per mezzo di analisi e test ELISA Griess come abbiamo descritto precedentemente 7, 8. Tutti i dati hanno mostrato in questa figura è rappresentativa di due o tre esperimenti indipendenti che mostrano risultati simili. I dati sono stati analizzati mediante ANOVA utilizzando il software GraphPad. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Rilevamento delle DC marcati nei tessuti sezionati. Etichettati DC mature (1x10 6 celle) sono state iniettate endovena in topi C57BL / 6. (A) Due giorni dopo i topi sono stati sacrificati e milza raccolti, congelati a scatto, integrati in ottobre, e 8 sezioni mM preparati utilizzando un criostato. Poi, i campioni sono stati fissati con acetone (15, min 4 ° C) e di contrasto con DAPI. Le cellule sono state valutate in un microscopio a fluorescenza come sopra Fig. 6a:. Ingrandimento 40X, Fig. 6b: ingrandimento 100X, fig. 6C, ingrandimento 400X.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Murine mieloidi) DC sono stati ampiamente utilizzati per determinare l&#39;efficacia e il miglioramento della DC a base di vaccini; indagare DC: le interazioni delle cellule T o di sviluppo corrente continua, e determinare il loro ruolo nelle varie patologie 9-11. Con la presente si mostra come generare DC da precursori recuperato zucchine osso di tibie e femori. Noi recuperare le ossa senza tagliare le punte, che ci permette di sterilizzare loro da immersione in etanolo al 70%, riducendo così la probabilità di contaminazione. Per differenziare i controller di dominio a partire da cellule del midollo osseo usiamo solo GM-CSF come descritto in precedenza 5. Anche se alcuni protocolli di utilizzare anche IL-4, è stato riferito che questa citochina non è necessaria quando si lavora con alti livelli di GM-CSF 12. Infatti, abbiamo già dimostrato che questi controller di dominio sono in grado di indurre risposte immunitarie 13. Inoltre, la cura deve essere presa per recuperare le cellule solo vagamente aderente da 8 giorni di culture lavando i piatti di Petri con il mezzo da quando le cellule allegato mostrano un fenotipo più monociti-like. Qui si mostra l&#39;etichettatura dei PVS con particelle fluorescenti Qdot. Tale etichettatura ha alcuni vantaggi rispetto ad altri metodi. In primo luogo, le particelle Qdots sono facilmente incorporato nelle cellule. In secondo luogo, il segnale fluorescente è molto alta e non è influenzata dal maturazione DC. In terzo luogo, la fluorescenza non è persa quando le cellule o tessuti sono fissati con solventi come l&#39;acetone, contrariamente a quanto succede se GFP è usato per codificare DC 14, dando maggiore flessibilità al momento di scegliere protocolli di colorazione. Infine, il segnale di fluorescenza ad alta dato da queste particelle permette di visualizzare le cellule dei tessuti, nonostante l&#39;auto-fluorescenza. Come descritto in precedenza 6, colorazione Qdot non ha influenzato la capacità di maturazione di queste cellule. Con la presente ci dimostrano che Qdot macchiati DC si comportano in modo simile a come non macchiato DC, upregulating molecole co-stimolatorie, e la produzione di IL-6 e l&#39;ossido nitrico in risposta a stimoli infiammatori. Sebbene DC sono cellule specializzate nello scatenare la risposta immunitaria, hanno dimostrato di partecipare in condizioni patologiche come il cancro e l&#39;aterosclerosi 4, 15, 16. Sono stati inoltre affermato di partecipare al processo di angiogenesi 17, 18, ​​anche suggerito come strutturalmente partecipare alla sviluppo di nuovi vasi 19, 20. Così, i metodi che permettono di DC monitoraggio in vivo, e determinare la loro localizzazione geografica in diversi tessuti 4, 21, 22 sono molto preziosi.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> C57BL / 6 topi </td><td> Jackson laboratori </td><td></td><td> Le femmine, 6-8 settimane di età </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino, qualificato </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotico-antimicotico </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> Buffer di lisi ACK </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Ricombinante murino GM-CSF </td><td> Peprotech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 celle Kit Etichettatura </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolisaccaride </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Ricombinante murino TNF alfa </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi CD86 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi CD40 </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Sistema reagente Griess </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 la cattura anticorpale </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 rilevazione degli anticorpi </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generazione e l&#39;etichettatura di murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli qdot per gli studi inseguimento

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Le cellule dendritiche (DC) sono cellule che presentano l&#39;antigene professionali (APC) ha trovato nei tessuti periferici e negli organi immunologiche come timo, midollo osseo, milza, linfonodi e placche di Peyer 1-3. DC presenti nel campione dei tessuti periferici dell&#39;organismo per la presenza di antigeni, che occupano, di processo e presente nella loro superficie, nel contesto di molecole di istocompatibilità (MHC). Poi, antigene-caricato DC migrare verso gli organi immunologici quando queste presentano l&#39;antigene ai linfociti T trattati innescare risposte immunitarie specifiche. Un modo per valutare le capacità migratorie di DCS è di etichettarli con coloranti fluorescenti 4. Con la presente ci dimostrano l&#39;utilizzo di nanocristalli Qdot fluorescenti di etichettare derivate dal midollo osseo murino DC. Il vantaggio di questa etichettatura è che Qdot nanocristalli in possesso di stabile e di lunga durata fluorescenza che li rendono ideali per la rilevazione di cellule marcate nei tessuti recuperati. Per fare questo, le prime cellule saranno recuperati dal zucchine osso murini e coltivate per 8 giorni in presenza di granulociti e macrofagi fattore stimolante le colonie al fine di indurre la differenziazione DC. Queste cellule verranno poi etichettati con Qdots fluorescente da breve incubazione in vitro. Cellule colorate possono essere visualizzati con un microscopio a fluorescenza. Le celle possono essere iniettati in animali da laboratorio, a questo punto o può essere in cellule mature al momento in incubazione in vitro con stimoli infiammatori. Nelle nostre mani, la maturazione DC non ha determinato la perdita di segnale fluorescente né colorazione Qdot influire sulle proprietà biologiche dei PVS. Una volta iniettato, queste cellule possono essere identificate in organi immunitario con la microscopia a fluorescenza seguenti dissezione tipici e le procedure di fissaggio.

Antigeni assorbimento delle cellule dendritiche e migrare verso gli organi immunitario di presentare antigeni alle cellule T trattati. Qdot nanocristalli etichettatura fornisce un segnale di lunga durata e stabile fluorescenti. Questo permette di tenere traccia delle cellule dendritiche a diversi organi mediante microscopia a fluorescenza.

Generazione e l&#39;etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

Le cellule dendritiche (DCs) sono cellule professionali presentanti l'antigene (APCs) presenti nei tessuti periferici e negli organi immunologici come il timo, l'osso...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare cellule dendritiche per studi di imaging mediante l'uso di nano cristalli Q dot. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto le cellule del midollo osseo dai femori e tibie di topo. Successivamente, vengono allestite colture di cellule del midollo osseo per favorire la differenziazione cellulare in cellule dendritiche in presenza di GM CSF.Successivamente, le cellule dendritiche vengono recuperate dalle colture di cellule del midollo osseo dopo otto giorni. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'effettuare la colorazione delle cellule con nano cristalli fluorescenti Q. Infine, le cellule dendritiche fortemente colorate possono essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza.Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnologia rispetto ad altri metodi, come l'uso di cellule dendritiche marcate con GFP, è che i nano cristalli Q dot conservano la loro fluorescenza anche dopo la colorazione con solventi organici come l'acetone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali per i biologi delle cellule dendritiche, come ad esempio le proprietà di migrazione di queste cellule in diverse malattie o in contesti patologici differenti. La procedura di colorazione sarà dimostrata da Maria Ali, una studentessa laureanda del mio laboratorio.Dopo l'eutanasia, dissezionare con cura la tibia e il femore di due topi senza recidere le estremità ossee. Quindi utilizzare carta da filtro per rimuovere tutti i tessuti aderenti dalle ossa, avendo cura di non romperle. In una cappa a sicurezza biologica.Riempire una piastra di Petri da 35 millimetri con etanolo al 70% e immergere quindi le ossa nell'etanolo per 10 minuti. Dopo aver sterilizzato le ossa, recuperarle dall'etanolo e lasciarle asciugare all'aria per cinque minuti in una nuova piastra di Petri. A questo punto, tagliare il femore al centro e la tibia alla loro estremità più sottile.Iniettare l'interno delle ossa con un millilitro di mezzo RPMI utilizzando una siringa sterile. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri e lavarla due volte con mezzo RPMI mediante centrifugazione a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius in una centrifuga dotata di rotore a cestelli oscillanti. Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere le cellule in due millilitri di tampone per la lisi dei globuli rossi (CK lysis buffer) e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al fine di eliminare i globuli rossi.Successivamente, aggiungere 13 millilitri di RPMI più 10% di FBS e lavare le cellule altre due volte in questo mezzo utilizzando le stesse impostazioni della centrifuga di prima. Contare le cellule e regolare la concentrazione a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro. Con RPMI più 10% di FBS, aggiungere G-M-C-S-F murino ricombinante a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro.Quindi aggiungere 10 millilitri di questa sospensione in una piastra di Petri sterile da 10 centimetri di qualità microbiologica e coltivare. La sospensione cellulare in un incubatore a anidride carbonica. Tre giorni dopo, aggiungere altri 10 millilitri di RPMI più 10% di FBS con 20 nanogrammi per millilitro di G-M-C-S-F murino ricombinante a ciascuna delle piastre preparate.Tre giorni dopo, recuperare 10 millilitri di sospensione cellulare da ogni piastra di Petri, centrifugare le cellule nelle stesse condizioni e risospendere il pellet nello stesso volume di RPMI aggiunto di 10% FBS prelevato dalle piastre di Petri, integrando con nuova G-M-C-S-F murina ricombinante. Infine, reinserire la sospensione cellulare in ciascuna piastra di Petri originale e coltivare le cellule per altri due giorni nell'incubatore a biossido di carbonio. Dopo otto giorni di coltura, recuperare le cellule in sospensione e quelle debolmente aderenti lavando le piastre di Petri con mezzo fresco.Quindi etichettare le cellule raccolte con il kit di etichettatura cellulare Q tracker 655 seguendo rigorosamente le istruzioni del produttore per etichettare cinque volte 10 alla sesta di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo murino con nano cristalli Q a una concentrazione di 10 nano moli. Mescolare innanzitutto cinque microlitri di ciascuno dei componenti del kit A e B in una provetta eppendorf e incubare la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere un millilitro di RPMI più 10% di FBS e vortexare la provetta per 30 secondi.Successivamente, aggiungere cinque volte 10 alla quinta di Dcs sospesi in 0,5 millilitri di RPMI più 10% FBS nel tubo einor e incubare le cellule nella soluzione D a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi lavare le cellule due volte in RPMI più 10% FBS nelle stesse condizioni di prima e risospendere il pellet in RPMI.Questa figura mostra un esempio di microfotografia fluorescente di dcs. Immediatamente dopo la marcatura, una goccia di cellule marcate è stata depositata su un vetrino e coperta con un coprioggetto. Successivamente, i campioni sono stati valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.In questa figura, può essere osservata un'etichettatura in microfotografia fluorescente delle cellule dendritiche dopo 48 ore di maturazione in vitro. Le cellule dendritiche sono state coltivate per 48 ore con 100 nanogrammi per millilitro di LPS e 20 nanogrammi per millilitro di TNF-alfa in camere da coltura su vetrino, in un incubatore a anidride carbonica. Successivamente, i campioni sono stati lavati con PBS, fissati con acetone, controcolorati con DPI e valutati mediante microscopio fluorescente.I DC marcati maturati in vitro sono stati analizzati mediante citometria a flusso. Le cellule marcate con Q dot mostrano un segnale intenso nel canale FL3. I DC marcati e non marcati con Q dot sono stati inoltre colorati con anticorpi specifici contro i marcatori di maturazione CD86 e CD40, e con controlli di isotipo. Le cellule sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso. Inoltre, i livelli di IL-6 e di ossido nitrico sono stati determinati nei supernatanti dei DC maturati marcati con Q dot e nei controlli.Di seguito è mostrata una figura rappresentativa di DCS marcate in un tessuto dissezionato. I DC maturi sono stati iniettati per via endovenosa in topi C57 Black Six. Dopo tre giorni, i topi sono stati sacrificati e le milze sono state raccolte.Tagli di otto micron, congelati rapidamente in OCT, sono stati preparati utilizzando un criostato. I campioni sono quindi stati fissati con acetone, controcolorati con DPI e valutati mediante microscopio a fluorescenza. Successivamente a queste procedure.Possono essere eseguiti altri metodi, come la presentazione dell'antigene o la maturazione con diversi stimoli, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sulla migrazione delle cellule dendritiche in risposta a diversi stimoli di maturazione.

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