Generazione e l'etichettatura di Murine osseo cellule dendritiche derivate dal midollo con nanocristalli Qdot per gli Studi inseguimento

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare le cellule dendritiche per gli studi di imaging utilizzando nanocristalli Q dot. Ciò si ottiene isolando prima le cellule del midollo osseo da murn, femori e tibie. Successivamente, vengono allestite colture cellulari di midollo osseo per facilitare la differenziazione cellulare in cellule dendritiche in presenza di GM CSF.

Quindi le cellule dendritiche vengono recuperate dalle colture cellulari del midollo osseo dopo otto giorni. La fase finale della procedura consiste nel colorare le cellule con nanocristalli Q fluorescenti. In definitiva, le cellule dendritiche colorate in modo brillante possono essere visualizzate mediante microscopia a fluorescenza.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnologia rispetto ad altri metodi, come l'utilizzo di celle dendritiche con tag GFP, è che i nanocristalli Q dot mantengono la loro fluorescenza anche dopo la colorazione con solventi organici come l'acetone. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei biologi delle cellule dendritiche, come le proprietà di migrazione di queste cellule in diverse malattie o nel contesto di diverse malattie. A dimostrare la procedura di colorazione sarà Maria Ali, una studentessa laureata del mio laboratorio.

Dopo il sacrificio, sezionare con cura la tibia e i femori di due topi senza tagliare le estremità ossee. Quindi usa la carta velina per pulire tutti i fazzoletti attaccati dalle ossa, facendo attenzione a non romperli. In una cappa di biosicurezza.

Riempi una capsula di Petri da 35 millimetri con etanolo al 70%, quindi immergi le ossa nell'etanolo per 10 minuti. Dopo che le ossa sono state sterilizzate, recuperatele dall'etanolo e lasciatele asciugare all'aria per cinque minuti in una nuova capsula di Petri. Ora, taglia il femore al centro e la tibia dalla punta più sottile.

Infondere l'interno delle ossa con un millilitro di terreno RPMI utilizzando una siringa sterile. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri e lavarla due volte con mezzo RPMI mediante una centrifugazione di 10 minuti a 300 volte G a quattro gradi Celsius in una centrifuga con rotore a secchiello oscillante. Dopo l'ultimo lavaggio, sospendere nuovamente le cellule in due millilitri di lisi CK, tamponare e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per eliminare i globuli rossi.

Quindi, aggiungere 13 millilitri di RPMI più il 10% di FBS e lavare le celle altre due volte in questo mezzo con le stesse impostazioni della centrifuga di prima. Contare le cellule e regolare la concentrazione a due volte da 10 alla quinta cellula per millilitro. Con RPMI più il 10% di FBS, aggiungere il G-M-C-S-F murino ricombinante a una concentrazione finale di 20 nanogrammi per millilitro.

Quindi aggiungere 10 millilitri di questa sospensione a una piastra di Petri sterile di qualità microbiologica da 10 centimetri e alla coltura. La sospensione cellulare in un incubatore ad anidride carbonica. Tre giorni dopo, aggiungere altri 10 millilitri di RPMI più il 10% di FBS con 20 nanogrammi per millilitro di G-M-C-S-F murino ricombinante a ciascuna delle piastre preparate.

Altri tre giorni dopo, recuperare 10 millilitri di sospensione cellulare da ciascuna piastra di Petri, centrifugare le cellule nelle stesse condizioni e risospendere il pellet nello stesso volume di RPMI più il 10% di FBS recuperato dalle piastre di Petri e rifornire con nuovo G-M-C-S-F murino ricombinante. Infine, rimettere la sospensione cellulare in ciascuna capsula di Petri originale e coltivare le cellule per altri due giorni nell'incubatore ad anidride carbonica. Dopo otto giorni di coltura, recuperare le cellule galleggianti e poco aderenti lavando le piastre di Petri con terreno fresco.

Quindi etichettare le cellule raccolte con il kit di etichettatura cellulare Q tracker 6 55 seguendo rigorosamente le istruzioni del produttore per etichettare da cinque volte 10 a un sesto delle dcs derivate dal midollo osseo murino con nanocristalli Q a una concentrazione di 10 nano molari. Per prima cosa mescola cinque microlitri di ciascuno dei componenti del kit A e B in una provetta einor e incuba la miscela per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere un millilitro di RPMI più il 10% di FBS e agitare il tubo per 30 secondi.

Quindi, aggiungi cinque volte 10 al quinto. Dcs sospeso in 0,5 millilitri di RPMI più il 10% di FBS nella provetta einor e incubare le cellule nella soluzione D a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Quindi lavare le celle due volte in RPMI più il 10% di FBS nelle stesse condizioni di prima e risospendere il pellet in RPMI.

Questa figura mostra un esempio di una micro fotografia fluorescente di c.d. Subito dopo l'etichettatura, una goccia di cellule marcate è stata depositata su un vetrino e coperta da un vetrino. Quindi i campioni sono stati valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

In questa figura, una micro fotografia fluorescente della dcs dopo 48 ore, la maturazione in vitro può essere vista etichettata. I Dcs sono stati coltivati per 48 ore con 100 nanogrammi per millilitro, LPS e 20 nanogrammi per millilitro, TNF alfa su camere di coltura a vetrino in un incubatore ad anidride carbonica. Quindi i campioni sono stati lavati con PBS fissato con acetone, controcolorato con DPI e valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Le dcs marcate maturate in vitro sono state analizzate mediante citometria a flusso, le cellule colorate con punti Q danno un segnale forte nel FL a tre canali, Q colorato e non colorato. Le Dcs sono state inoltre colorate con anticorpi specifici contro i marcatori di maturazione, CD 86 e CD 40, e le cellule di controllo dell'isotipo sono state quindi analizzate mediante citometria a flusso. Inoltre, i livelli di IL 6 e ossido nitrico sono stati determinati nei surnatanti della MDD matura con colorazione Q e nei controlli.

Qui viene mostrata una figura rappresentativa della MDD marcata in un tessuto sezionato. Le dcs mature sono state iniettate per via endovenosa in topi C 57 black six. Tre giorni dopo, i topi sono stati sacrificati e la milza è stata raccolta.

Lo snap frozen incorporato nell'OCT e le sezioni di otto micron sono state preparate utilizzando un criostato. I campioni sono stati quindi fissati con acetone, controcolorati con DPI e valutati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Seguendo queste procedure.

Altri metodi, come la posa o la maturazione dell'antigene con stimoli diversi, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come la migrazione delle cellule dendritiche in risposta a diversi stimoli di maturazione.