Calorimetria isotermica di titolazione di misura macromolecola-ligando di affinità
7 settembre 2011
Un protocollo generale per l'uso di calorimetria isotermica di titolazione per monitorare la termodinamica vincolante per i sistemi biologici con moderata affinità di legame è presentato.
L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una tecnica generale per lo studio dell'interazione tra ligando e macromolecola mediante calorimetria di titolazione isoterma, o ITC. Questo viene ottenuto preparando innanzitutto soluzioni di ligando e macromolecola prive di impurezze e con composizione del tampone e pH identici. Successivamente vengono determinate le concentrazioni finali delle soluzioni di ligando e macromolecola.
I successivi parametri sperimentali di ITC vengono impostati, seguiti dalla raccolta dei dati. L'ultimo passaggio della procedura consiste nell'analizzare e adattare i dati. Alla fine, i risultati che mostrano le interazioni tra ligando e macromolecola si ottengono mediante analisi grafica dei dati di titolazione per determinare i parametri di legame e quelli termodinamici.
Il principale vantaggio di questa tecnica di legame rispetto ai metodi esistenti, come le titolazioni per assorbimento e fluorescenza, è che l'entalpia e quindi l'entropia del legame possono essere determinate dallo stesso esperimento. La preparazione del campione inizia con la determinazione delle concentrazioni appropriate sia per il macromolecola che per il ligando. Un passaggio fondamentale per ottenere informazioni accurate di adattamento ITC da considerare durante il calcolo di queste concentrazioni è riportato nella procedura scritta.
In questo esperimento, si studia il legame del co-fattore N-A-D-P-H con l'enzima diidrofolato reduttasi codificato dal cromosoma di e coli. Per prima cosa, ricostituire la macromolecola liofilizzata nel tampone alla concentrazione desiderata, quindi sciogliere il ligando nel volume necessario di tampone. Successivamente, verificare che i valori di pH della macromolecola e del campione di ligando siano compresi entro ± 0,05 unità di pH rispetto al tampone e tra loro; centrifugare quindi entrambe le soluzioni di diidrofolato reduttasi cromosomica e di N-A-D-P-H in provette da microcentrifuga per cinque minuti.
A 8.000-14.000 giri al minuto, questo passaggio farà sedimentare qualsiasi particella presente in soluzione, che potrebbe causare artefatti nella linea di base del termogramma ITC. Dopo la centrifugazione, verificare attentamente le concentrazioni delle soluzioni di macromolecola e ligando mediante spettroscopia UV-Vis e registrare le loro concentrazioni esatte.
Quindi, preparare il volume appropriato di ciascuna soluzione per ITC diluendo le soluzioni stock del macromolecola e del ligando alle concentrazioni sperimentali necessarie. Infine, sottoporre i campioni a degasaggio per evitare artefatti del segnale dovuti a bolle d'aria o al rilascio di gas disciolti durante la titolazione, prima di caricare il macromolecola e il ligando nell'ITC. Pulire la cella campione e la siringa di iniezione seguendo il protocollo del produttore.
Quindi risciacquare la cella del campione due o tre volte con 1,8 millilitri di acqua distillata utilizzando una siringa Hamilton. Prestare attenzione durante la manipolazione della siringa poiché la punta lunga si piega facilmente. Successivamente, risciacquare la cella del campione diverse volte con lo stesso volume di tampone.
Una volta che la cella del campione è pulita, caricare 1,8 millilitri della soluzione del macromolecola nella cella. Essere attenti ad evitare la formazione di bolle nel momento in cui la soluzione fuoriesce dal gambo della cella, quindi interrompere l'aggiunta del campione. Rimuovere eventuali bolle d'aria utilizzando la siringa Hamilton, muovendo delicatamente l'ago su e giù lungo i lati della cella per eliminare le bolle presenti.
Estrarre la siringa e rimuovere il volume in eccesso dal pozzetto nella parte superiore della cella. Successivamente, riempire la cella di riferimento con acqua distillata. Quindi, fissare una siringa di plastica al porto di riempimento della siringa di iniezione utilizzando un tubicino.
Aprire la porta di riempimento sulla console VP viewer 2000. Sciacquare la siringa di iniezione con acqua distillata, seguito da uno sciacquo con tampone. Assicurarsi che la siringa di iniezione sia completamente svuotata aspirando aria attraverso il sistema.
Inserire l'ago della siringa di iniezione nella soluzione del ligando e aspirare la soluzione nella siringa fino a riempirla completamente. Continuare ad aspirare un leggero eccesso di volume attraverso il porto e staccare il tubo immediatamente dopo la chiusura del porto di riempimento. Staccare il tubo e la siringa di plastica, quindi svuotare e riempire nuovamente la siringa di iniezione due volte per eliminare eventuali bolle d'aria dalla siringa.
Rimuovere la siringa di iniezione dalla soluzione del ligando e asciugare eventuali gocce laterali con un panno chimico. Fare attenzione a non toccare la punta della siringa con il panno chimico né a urtare la siringa, poiché ciò potrebbe causare una perdita di volume dalla siringa. Successivamente, inserire con cura la siringa di iniezione nella cella del campione.
Impostare i parametri per l'esecuzione della calorimetria isotermica di titolazione (ITC) utilizzando il programma V VP viewer 2000 fornito da Micro Cal per sistemi di legame. Con segnali termici intensi, come nel sistema cromosomico DIIDROFOGLATO reduttasi N-A-D-P-H, un elevato numero di iniezioni a basso volume fornirà un maggior numero di punti dati per l'adattamento della curva. Al contrario, per sistemi con segnali termici deboli, è preferibile utilizzare un ridotto numero di iniezioni ad alto volume.
Per le prime una o due iniezioni, impostare il volume di iniezione a due microlitri. Queste iniezioni verranno successivamente scartate poiché potrebbero produrre risultati fuorvianti a causa del mescolamento tra le soluzioni di ligando e di macromolecola. Quando si inserisce il tempo tra le iniezioni, prevedere alcuni minuti affinché il sistema raggiunga l'equilibrio e il segnale termico ritorni alla linea di base.
Quindi scegliere la temperatura dell'esperimento e impostare la velocità di agitazione della siringa necessaria per un'adeguata miscelazione del ligando e della macromolecola durante la titolazione, dopo aver configurato i parametri sperimentali, quindi avviare l'esperimento. Al termine dell'esperimento, il segnale di calore finale dovrebbe essere prossimo alla saturazione. Pulire il calorimetro ITC seguendo il protocollo del produttore ed eseguire nuovamente le titolazioni almeno altre una o due volte per ottenere dati riproducibili.
Infine, eseguire un controllo in cui il ligando viene titolato nel buffer nella cella campione per determinare il calore di diluizione del ligando. L'adattamento dei dati può essere facilmente eseguito utilizzando macro in qualsiasi programma di adattamento dati. Origin 7 fornito da Micro Cal viene utilizzato qui per dimostrare l'adattamento dei dati. Per iniziare, caricare il primo file di dati.
Controllare il termogramma grezzo alla ricerca di bolle d'aria o di altri artefatti nel segnale, nel caso siano presenti artefatti come picchi nella linea di base o picchi in assenza di un punto di iniezione. Annotare questi punti dati poiché dovrebbero essere rimossi. Successivamente, caricare i dati del controllo di diluizione del ligando e sottrarli dall'isoterma di legame in questo momento.
Rimuovere tutti i punti dati spurii, inclusi i primi punti della titolazione in cui si verificano tipicamente artefatti di diluizione. Quindi selezionare il modello di adattamento dei dati. Una volta scelto il modello, i dati possono essere adattati inserendo manualmente i valori iniziali stimati dei parametri di adattamento, tra cui stechiometria, entalpia e affinità di legame.
Tuttavia, se si conoscono già alcuni parametri grazie a esperimenti ortogonali, questi valori devono essere inseriti poiché aiutano a evitare che i dati rimangano intrappolati in minimi locali durante l'adattamento. Una volta adattati i dati della prima titolazione, ripetere i passaggi di analisi per il resto degli isotermi. In alternativa, i dati possono essere adattati globalmente utilizzando un programma come said fat; per iniziare un adattamento globale, salvare i dati in origin come file dot dat.
Quindi importare i dati nel suddetto grasso. Scegliere un modello per l'adattamento e adattare globalmente i dati passando avanti e indietro tra le opzioni di adattamento simplex e Mark HAR Leven fino a quando il valore globale del chi-quadro non ha raggiunto un minimo. La procedura rappresentativa di calorimetria isotermica di titolazione dimostrata in questo video monitora il legame del N-A-D-P-H alla deidrofolato reduttasi cromosomica di e coli.
Il legame esotermico del N-A-D-P-H alla diidrofolato reduttasi è evidente nel termogramma grezzo, poiché viene rilasciato calore. La diminuzione del segnale termico ad ogni iniezione successiva indica la saturazione del legame, che avviene nella prima metà della titolazione. La purezza dei componenti e la buona corrispondenza dei tamponi sono evidenti dalla porzione saturata del grafico, in cui sono presenti solo segnali termici minimi derivanti dal calore di diluizione del ligando.
I dati sono stati adattati a un modello ad un singolo sito utilizzando il software Origin per rivelare l'isoterma di legame. Successivamente, due set di dati sono stati adattati a un modello ad un singolo sito utilizzando detto software. I valori ridotti e il pattern casuale dei residui indicano che i parametri termodinamici sono ragionevoli. Questi parametri sono inoltre validati mediante confronto con valori presenti in letteratura ottenuti attraverso metodi ortogonali.
Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare il legame tra ligandi e macromolecole utilizzando un ITC VP di MicroCal, preparando correttamente le soluzioni, impostando i parametri sperimentali e analizzando i dati.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un protocollo generale per l'uso della calorimetria di titolazione isoterma (ITC) nello studio del legame tra ligandi e macromolecole nei sistemi biologici. Il metodo consente di determinare la termodinamica del legame, inclusi entalpia ed entropia, a partire da un singolo esperimento.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chimica biochimica
- Termodinamica
- Chimica biofisica
Sfondo
- La calorimetria di titolazione isoterma è una tecnica potente per lo studio delle interazioni molecolari.
- Fornisce informazioni sulle affinità di legame e sui parametri termodinamici.
- Una preparazione accurata dei campioni è fondamentale per ottenere risultati affidabili di ITC.
- Questo protocollo si concentra sul legame tra N-A-D-P-H e la diidrofolato reduttasi di E. coli.
Scopo dello studio
- Dimostrare una tecnica generale per lo studio delle interazioni ligando-macromolecola.
- Evidenziare i vantaggi della calorimetria isoterma (ITC) rispetto ad altri metodi di studio del legame.
- Fornire un protocollo dettagliato per l'esecuzione di esperimenti di calorimetria isoterma (ITC).
Metodi Utilizzati
- Preparazione delle soluzioni di ligando e macromolecola.
- Impostazione dei parametri sperimentali di ITC.
- Raccolta ed analisi dei dati mediante software di fitting.
- Analisi grafica dei dati di titolazione per determinare i parametri di legame.
Risultati principali
- Dimostrazione riuscita delle interazioni tra ligando e macromolecola.
- Determinazione dei parametri di legame e termodinamici.
- Confronto tra la calorimetria isotermica di titolazione (ITC) e altre tecniche di legame.
- Dati riproducibili ottenuti da multiple titolazioni.
Conclusioni
- La ITC è un metodo efficace per lo studio della termodinamica delle interazioni molecolari.
- Il protocollo può essere adattato a diversi sistemi biologici.
- Una preparazione accurata dei campioni e un'analisi dati precisa sono essenziali per ottenere risultati affidabili.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La calorimetria di titolazione isoterma (ITC) fornisce un metodo in soluzione, privo di etichette, per quantificare la termodinamica del legame tra macromolecole e ligandi, consentendo la validazione precoce delle proteine bersaglio grazie all'ottenimento, in un singolo esperimento, di dati sull'affinità, sulla stechiometria e sull'entalpia. Questo approccio supporta la riduzione del rischio meccanicistico nella fase di scoperta confermando il legame diretto e escludendo artefatti del saggio, un aspetto fondamentale per prioritizzare bersagli con elevata affidabilità predittiva. La tecnica guida le decisioni di avanzamento o interruzione nella fase di identificazione dei composti attivi, stabilendo i parametri di base del legame prima di investire in campagne di screening o ottimizzazione successive.
Applicazioni strategiche nella ricerca e sviluppo biotecnologico-farmaceutico
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: La misurazione diretta dell'affinità di legame e della stechiometria consente un'analisi rigorosa delle ipotesi terapeutiche e chiarisce le interazioni tra bersaglio e ligando.
- Valore operativo: Il rilevamento senza etichette evita falsi positivi derivanti da interferenti fluorescenti o assorbenti, aumentando l'affidabilità dei dati relativi al legame al bersaglio.
- Valore predittivo: Il profilo termodinamico (ΔH, ΔS) supporta la riduzione del rischio meccanicistico rivelando le forze trainanti del legame, facilitando l'ottimizzazione del composto leader e la valutazione della selettività.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: I valori di Kd ottenuti mediante ITC stabiliscono parametri di riferimento per lo sviluppo di saggi biochimici o cellulari, garantendo la rilevanza rispetto alle condizioni native di legame.
- Riproducibilità: Una preparazione standardizzata dei campioni e l'abbinamento dei tamponi consentono risultati costanti tra diverse prove, favorendo il trasferimento del saggio tra gruppi di scoperta e preclinici.
- Scalabilità: Il basso consumo di campione e la compatibilità con sistemi di titolazione automatizzati permettono l'integrazione della ITC in flussi di lavoro a media produttività per la selezione dei composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: I parametri di legame ottenuti mediante calorimetria a titolazione isoterma (ITC) informano la modellizzazione farmacocinetica/farmacodinamica fornendo costanti di interazione con il bersaglio pertinenti all'efficacia in vivo.
- Avanzamento con Valutazione del Rischio: I dati di affinità e entalpia aiutano a distinguere il legame specifico da quello non specifico, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate dovuto a effetti fuori bersaglio.
- Allineamento con i Biomarcatori: Quando combinati con dati strutturali o cellulari, i risultati della ITC supportano le strategie basate su biomarcatori confermando la modulazione del bersaglio in sistemi pertinenti alla malattia.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'ITC si inserisce nel percorso della scoperta come metodo biofisico primario per la validazione del bersaglio, collegando la verifica iniziale delle ipotesi all'identificazione dei composti promettenti grazie ai dati quantitativi sull'interazione che guidano la chimica farmaceutica e la progettazione dei saggi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi mediante la misurazione diretta dell'affinità tra ligando e macromolecola, consentendo la riduzione dei rischi biologici sui bersagli prima di investimenti significativi.
- Screening: Fornisce soglie di affinità e firme termodinamiche che guidano la progettazione degli assay e la conferma dei risultati positivi negli screening primari e secondari.
- Analisi: Fornisce come risultati principali la stechiometria, l'affinità di legame (Kd), l'entalpia (ΔH) e l'entropia (ΔS), utilizzati per confrontare serie di ligandi e indirizzare l'ottimizzazione.
- Ricerca traslazionale: Collega il legame in vitro alla rilevanza preclinica stabilendo parametri di riferimento per il coinvolgimento del bersaglio nei modelli di efficacia.
- Riutilizzo aziendale: Agnostico alla piattaforma e applicabile a diverse famiglie proteiche, la calorimetria isoterma di titolazione (ITC) rappresenta una capacità riutilizzabile in più progetti senza necessità di riconvalida.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduzione dell'ambiguità meccanicistica mediante misurazioni termodinamiche dirette, aumentando la fiducia nel meccanismo d'azione del legame tra bersaglio e ligando.
- Valore operativo: Flussi di lavoro standardizzati per la preparazione dei campioni, l'abbinamento dei tamponi e l'analisi dei dati garantiscono riproducibilità tra diversi siti e progetti.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosegui/non-prosegui identificando precocemente leganti deboli o non specifici, riducendo gli sforzi sprecati in chimica farmaceutica.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio fornendo dati sul legame che informano sulla druggabilità del bersaglio e sull'idoneità del capostipite.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in chimica biofisica e nell'interpretazione di dati termodinamici per progettare esperimenti ed evitare errori comuni come l'aggregazione o le incompatibilità tra tamponi.
- È subordinato all'accesso a strumenti di calorimetria a titolazione isotermica (ITC) calibrati e a strumenti complementari (ad esempio, spettroscopia UV-Vis) per determinare con precisione le concentrazioni.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nei protocolli di preparazione dei campioni, in particolare per lo scambio di tampone e la rimozione di impurezze, al fine di garantire la confrontabilità dei dati.
- L'adattamento a diversi sistemi modello richiede l'ottimizzazione degli intervalli di concentrazione e dei parametri di titolazione in base al valore previsto di Kd e ai limiti di solubilità.
- I limiti pratici includono la sensibilità al calore di diluizione, la necessità di campioni ad alta purezza e una produttività relativamente bassa rispetto ai saggi basati sulla fluorescenza.
