Name: Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri la coltura tridimensionale di organoidi ovarici e tubarici in idrogeli di alginato. Questo metodo permette di studiare gli eventi iniziali della formazione del cancro ovarico mantenendo le caratteristiche cellulari native.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di Ricerca sul Cancro ovarico [concedere LT/UIC/01.2011], il Centro UIC per la scienza clinica e traslazionale, il Cancer Center UIC, e il National Institutes of Health concedere C06RR15482. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal AAALAC sotto protocolli animali approvati cura dalla cura degli animali e del Comitato Usa a UIC. Animali per questo progetto sono alloggiati in camere barriera nel Laboratorio risorse biologiche (BRL) presso l&#39;Università dell&#39;Illinois a Chicago. Il BRL dispone di uno staff completamente veterinario che controlla gli animali, almeno due volte al giorno e fornisce consigli sulla cura degli animali.

1. Ovarico dissezione e isolamento dei tessuti <ol><li> Preparare una soluzione allo 0,5% (w / v) di alginato di sodio, preparare da una versione modificata del protocollo descritto in precedenza 5, utilizzando PBS sterile e calore a 37 ° C. Miscelare invertendo o dondolo, ma non vortice. Disegnare la alginato in una siringa da 1 ml con un ago da 25 G e mantenere a 37 ° C. </li><li> Preparare 10mM sterile CaCl 2 soluzione per la reticolazione alginato su incapsulamento dei tessuti e calda a 37 ° C. </li><li> Preparare 1 ml di terreno di coltura (αMEM + 5 unità di penicillina e 5 mg / ml di streptomicina) per bene in un 24 pozzetti per ciascun esperimento. Comprendono diversi farmaci, peptidi, o virus nel terreno di coltura. Per la trasfezione prima di incapsulamento organo, incubare il tessuto con Lipofectamine il 2000 e il DNA plasmidico per quattro ore a 37 ° C. </li><li> Sezionare gli organi dall'animale, rimuovere eventuali residui di tessuto adiposo o, staccare delicatamente la membrana che circonda la borsa ovarica, e tagliare l'ovaio o ovidotto in quattro pezzi da bisecando l'organo. Gli animali sono stati sacrificati dalla CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. Per l'ovidotto, delicatamente srotolare il tessuto tirando fuori le membrane di collegamento ed estendendo le estremità del tubo in direzioni opposte con pinze prima di tagliare. </li><li> Inserire una singola goccia alginato (microlitri ~ 1-3) su una rete in fibra di sterilizzato. </li><li> Utilizzando pinza sterile, spostare un pezzo di organo nella goccia alginato e il centro della goccia con pinza o un ago sterile. </li><li> Invertire la goccia che contiene il pezzo d'organo (organoide) afferrando la rete in fibra con una pinza sterile e si rovescia per consentire la gravità di forzare l'alginato in una goccia. </li><li> Toccare la pinza sul bordo di un piatto di 10 centimetri di Petri contenente 10mM CaCl 2 soluzione in modo che la goccia cade in soluzione. </li><li> Incubare per 2 minuti, rimuovere con un cucchiaio di sterili contenenti pori di rilasciare supplementare 10mM CaCl 2, e trasferire nel terreno di coltura. Fino a quattro gel alginato può essere trasferito in un singolo pozzo di una piastra 24 pozzetti contenenti il ​​terreno di coltura. Cultura per un periodo di tempo definito. </li></ol> 2. Degrado di alginato e la raccolta di cellule <ol><li> Per la solubilizzazione del gel alginato, incubare le culture in alginato liasi (3,4 mg / ml) disciolto in L-15 Leibovitz dei media a 37 ° C per 30 minuti o fino a quando il gel è completamente sciolto. </li><li> Rimuovere il tessuto dal alginato liasi. </li><li> Per la raccolta delle OSE, incubare il organoide con 500 unità di collagenasi in Leibovitz L-15 supporti per 1 ora 8. Vortex in 2 impulsi secondo (2 secondi e 2 secondi vortice di riposo) su media potenza per 1 minuto, seguito da 1 impulsi secondo (1 vortice secondo e 1 secondo riposo) per 1 minuto. Lasciate cadere a pezzi organo fondo della provetta e sopranatante pipetta in fresco provetta sterile. Centrifugare 3 minuti a 3000 rpm per epitelio superficie ovarica pellet. </li><li> Per la raccolta dell'epitelio tubarico, tagliare il tubo della lunghezza e del luogo in plastica coltura in DMEM con 5 unità di penicillina e 5 mg / ml streptomicina e il 4% (v / v) di FBS. Più di 3-5 giorni, le cellule si "strisciare" fuori dello stroma tube e crescere in colture di tessuti plastic9. </li></ol> 3. Fissazione di culture organo alginato incapsulato per le sezioni di paraffina <ol><li> Raccogliere l'alginato incapsulato tallone dal terreno di coltura al punto di tempo selezionato. </li><li> Recrosslink l'alginato per irrigidire il gel facendo cadere la cultura in sterili 10mM CaCl 2 soluzione per due minuti. </li><li> Fissare l'organo alginato incapsulato nel 2% paraformaldeide saccarosio contenente 50 mm, 10 mm CaCl 2 e 50 mM di sodio cacodilato per garantire che il gel rimane solido e incapsula completamente il tessuto durante la fissazione. </li><li> A seguito di lavorazione dei tessuti, incorporare l'intero alginato-incapsulato pezzo cultura d'organo in paraffina e sezione con un microtomo per generare 5 sezioni micron. </li><li> L'alginato sarà sciolto e rimosso dalla diapositiva se si esegue l'immunoistochimica a causa del calore di recupero basato antigene. L'alginato resteranno e colorare per eosina in piedi e colorazione ematossilina eosina. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Un esempio di tridimensionale cultura organo dell'ovaio e ovidotto è mostrata in Figura 1. Ovaie possono essere tagliati in pezzi di diverse dimensioni, e OSE proliferare e migrare per riparare la superficie che è stato ferito dalla incisione con il bisturi. Durante questo processo, il corretto orientamento della OSE rispetto al sottostante stroma è mantenuto, con l'OSE incapsulare l'ovaio. Come mostrato nella Figura 2, l'OSE di ovaie tagliati a metà incapsulare le ovaie in modo più completo rispetto a ovaie tagliato in quarti o ottavi. La riparazione delle ferite del ovaricosuperficie può essere studiata nel contesto delle ovaie e tutto può far luce su come riparare l'ovulazione e la superficie induce la trasformazione della superficie dell'ovaio. L'endpoint dell'esperimento dipende dalle informazioni che è necessario. Architettura del tessuto, la morfologia cellulare e specifici tassi di crescita cellulare, possono essere facilmente monitorate utilizzando sezioni di paraffina. Ad esempio, un singolo strato di epitelio ovarico superficie si osserva dopo coltura nel siero senza αMEM per 7 giorni (Figura 3A), mentre l'aggiunta di 5 mg / ml di insulina per 7 giorni induce iperproliferazione dell'epitelio superficie ovarica e la formazione di strati multipli di cellule (Figura 3B). Aggiungendo bromodeossiuridina alle culture ad una concentrazione finale di 10 mM 24 ore prima della fissazione, la proliferazione delle cellule può essere misurata (inserto 3A e 3B). Per le culture mantenuto nel siero senza αMEM, circa il 3-5% di OSE subire proliferazione durante il periodo di 24 ore di etichettatura (3A riquadro), mentre una percentuale maggiore di cellule della granulosa proliferano. L'aggiunta di insulina per la cultura dei media aumenta la percentuale di proliferazione OSE a circa il 30% del totale OSE (3B riquadro). Immunofluorescenza di proteina fluorescente verde (GFP) possono essere visualizzati attraverso il gel alginato con microscopia seguente norma trasfezione del DNA (Figura 3C). Mentre organo cultura alginato offre per la crescita e l'analisi dell'epitelio ovarico superficie e follicoli primari, si deve rilevare che la maturità, i follicoli secondari non riescono a sopravvivere in questo sistema di coltura (Fig. 3D). Cultura dei follicoli singoli maturità all'interno di una matrice idrogel alginato è stata descritta altrove 10. Alterazioni di proteine ​​o RNA può essere analizzata da l'intero organo o da specifici tipi cellulari mediante degradazione enzimatica (Figura 4). Trattamento di organoidi ovarico coltura con collagenasi lascia intatto lo stroma sottostante (Figura 4C), pur consentendo l'arricchimento di OSE nel pellet ottenuto dopo il trattamento, anche se alcune cellule stromali sono anche isolate (fig. 4D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dell'ovaio mouse tridimensionale sistema di coltura utilizzato per propagare OSE dopo il ferimento. A) Sotto il microscopio, la borsa e il cuscinetto di grasso che circonda sono stati rimossi. B) ovaio intatto (O) con tubo oviductal (T) e grassi pad (F). C) ovaio con borsa e cuscinetto adiposo rimosso (a sinistra) e srotolato ovidotto (a destra). D) organoidi ovarica o oviductal sono stati collocati in una gocciolina alginato. E) organoidi alginato racchiusi furono rinviati ad una soluzione di CaCl 2 reticolazione l'alginato di formare un gel. F) alginato incapsulato organoide ovarico. G) alginato incapsulato organoide oviductal. H) organoidi alginato incapsulato incubati in terreno di coltura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Superficie rigenerato dalla superficie ovarica misurata con citocheratina 8. Incapsulamento di organoidi ovarico dal OSE dopo essere stato tagliato in ottavi, quarti, e la metà, coltivate in media BSA, e misurato attraverso l'analisi immunoistochimica utilizzando citocheratina 8 (CK8) anticorpi. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Sistema di coltura alginato permette il passaggio di fattori di crescita e di trasfezione di cDNA nel OSE, ma non supporta una rapida crescita e la maturazione dei follicoli. A) organoide ovarica in coltura per 7 giorni in media basale analizzati per CK8 espressione, che segna l'OSE. Incasso, sezione seriale macchiato per incorporazione di BrdU. B) L'aggiunta di insulina per i terreni di coltura induce iperplasia delle OSE. Incasso, sezione seriale macchiato per incorporazione di BrdU. C) organoide ovarica transfettate con cDNA per esprimere la GFP. D) la cultura del sistema alginato sostiene la crescita dei follicoli primordiali (freccia rossa), ma follicoli secondari non maturi (freccia nera). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/2804/2804fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. OSE possono essere isolati per la cultura successiva analisi. A) organoide coltivate in media per un massimo di 2 settimane. B) organoide incapsulato è trattato con alginato liasi di lasciare organoide intatto. Dell'ovaio è macchiato con CK8 per segnare OSE. C) organoide è trattato con collagenasi di OSE separato da stroma sottostante. Pezzo rimanente tessuto era macchiata di CK8 per evidenziare la rimozione della superficie dell'ovaio. D) le cellule raccolte dopo il trattamento sono arricchiti per OSE come colorate per CK8 (rosso). Le cellule sono di contrasto con DAPI per marcare i nuclei.

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</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Lo sviluppo di un sistema tridimensionale di organi cultura utilizzando idrogel alginato rappresenta un metodo versatile per l&#39;analisi di molti tipi di tessuto diverso da una grande varietà di organismi. L&#39;uso di colture 3D può essere estesa ai campi della ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa in quanto fornisce una impalcatura su cui le cellule possono crescere 11. Attualmente, il nostro laboratorio è in fase di studio iniziale, usando il tessuto ovarico umano e tube di Falloppio, tuttavia, ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Leibovitz L-15 di media </td><td> Gibco </td><td> 11415 </td><td></td></tr><tr><td> αMEM media </td><td> Gibco </td><td> 12000-022 </td><td></td></tr><tr><td> Alginato di sodio </td><td> Novamatrix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sodio cacodilato </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C0250 </td><td></td></tr><tr><td> Rete in fibra di polipropilene </td><td> McMaster Carr </td><td></td><td> 45 &quot;di larghezza rotolo; 0,0041&quot; apertura </td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Alginato liasi </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A1603 </td><td></td></tr><tr><td> A1603 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9697 </td><td> Da Clostridium histolyticum </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> MP Biomedicals </td><td> 103700 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco </td><td> Gibco </td><td></td></tr><tr><td> ITS </td><td> Roche </td><td> 11074547001 </td><td> Insulina / transferrina / sodio selenite </td></tr><tr><td> Citocheratina 8 anticorpi </td><td> Developmental Studies Ibridoma Banca </td><td> Troma-1 </td><td> Uso a 1:200 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Vector Labs </td><td> H1200 </td><td></td></tr><tr><td> Bromodeossiuridina </td><td> Sigma </td><td> B50002-1G </td><td> Concentrazione finale di 10 micron </td></tr></tbody></table>

idrogeli di alginato per tridimensionale cultura organo di ovaie e tube

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro nelle donne e ha un tasso di mortalità del 63% negli Stati Uniti 1. Il tipo di cellula d&#39;origine dei tumori ovarici è ancora in discussione e potrebbe essere sia l&#39;epitelio della superficie ovarica (OSE) o l&#39;epitelio distale del fimbrie tube di Falloppio 2,3. Coltura le cellule normali come una coltura primaria in vitro consentirà agli scienziati di modello cambiamenti specifici che potrebbero portare al cancro ovarico nell&#39;epitelio distinti, così definitivamente la determinazione del tipo di cellula di origine. Ciò permetterà lo sviluppo di biomarcatori più precisi, modelli animali con tessuto-specifici cambia gene, e migliori strategie di prevenzione mirate a questa malattia. Il mantenimento di cellule normali in idrogel alginato promuove a breve termine in coltura in vitro di cellule nel loro contesto tridimensionale e permette l&#39;introduzione di DNA plasmidico, siRNA e piccole molecole. Dagli organi coltura in pezzi che sono derivati ​​da tagli strategici con un bisturi, le culture diverse da un singolo organo può essere generato, aumentando il numero di esperimenti da un singolo animale. Questi tagli aspetti del modello di ovulazione porta alla proliferazione di OSE, che è associata alla formazione di cancro ovarico. Tipi di cellule come l&#39;OSE, che non crescono bene su superfici in plastica possono essere coltivate con questo metodo e facilitare l&#39;indagine nei normali processi cellulari o dei primi eventi nella formazione del cancro 4. Idrogel alginato può essere utilizzato per sostenere la crescita di molti tipi di tessuti 5. Alginato è un polisaccaride lineare composto da unità ripetute di β-D-mannuronico acido e α-L-guluronic acido che può essere reticolato con gli ioni calcio, con una conseguente azione gelificante delicata che non danneggiano i tessuti 6,7. Come per le altre cellule matrici tridimensionali cultura come Matrigel, alginato fornisce supporto meccanico per i tessuti, ma le proteine ​​non sono reattivi con la matrice di alginato, e quindi le funzioni alginato come matrice extracellulare sintetico che non avvia segnalazione cellulare 5. L&#39;idrogel alginato galleggia in media standard di coltura cellulare e supporta l&#39;architettura della crescita dei tessuti in vitro. Un metodo viene presentato per la preparazione, la separazione, e l&#39;inclusione di neoplasie ovariche e composizioni per organo oviductal in idrogel alginato, che possono essere mantenute in coltura per un massimo di due settimane. Il rilascio enzimatico delle cellule per l&#39;analisi di campioni di RNA e proteine ​​dalla cultura organo è anche descritto. Infine, la crescita di tipi di cellule primarie è possibile senza immortalizzazione genetica di topi e permette agli investigatori di utilizzare knockout e topi transgenici.

Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Il tumore ovarico rappresenta la quinta causa principale di morte per cancro nelle donne e presenta un tasso di mortalità del 63% negli Stati Uniti1. Il tipo cellulare di origine per...

Questa procedura descrive la propagazione di cellule epiteliali ovariche e delle tube di ovidotto normali come coltura organica tridimensionale. In primo luogo, dissezionare il cuscinetto adiposo ovarico e una parte dell'utero da un topo. Successivamente, rimuovere la borsa e separare le membrane tubariche con una pinzetta, quindi tagliare ciascuna ovaia o UCT in due o quattro frammenti denominati organoidi.Infine, incapsulare l'organoide in una goccia di alginato su un pezzo di fibra a maglia. Poiché le OSC e le TEC coltivate in mezzi definiti mantengono le caratteristiche cellulari normali nella loro architettura tridimensionale nativa, l'immunohistochimica su sezioni di tessuto, l'analisi dell'RNA e l'analisi delle proteine possono fornire informazioni sull'impatto delle OSC e delle TEC nel cancro ovarico.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alla tradizionale coltura cellulare immortale bidimensionale è che le cellule possono essere coltivate a contatto con la matrice extracellulare sottostante e con cellule stromali, senza l'immortalizzazione genetica che potrebbe alterare i percorsi cellulari. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel

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Un nuovo metodo per l'incapsulamento follicolo ovarico in una rete di fibrina-alginato 3D compenetrano è descritto. Questo sistema combina un sostegno strutturale con degradazione proteolitica per sostenere lo sviluppo dei follicoli immaturi per la produzione di ovociti maturi. Questo metodo può essere applicato agli aggregati di coltura cellulare per mantenere la cellula-cellula contatti senza limitare l'espansione.

Un metodo per l&#39;incapsulamento follicolo ovarico e la cultura in un proteoliticamente degradabile 3 Sistema dimensionale

Questo video descrive i protocolli per incapsulare i complessi cumulo-ovociti suini (COC) in perle di fibrina-alginato per stabilire una coltura 3D. Questo sistema di maturazione in vitro mantiene la normale comunicazione cellula-cellula, garantendo la maturazione degli ovociti e mantenendo la vitalità.

Coltura 3D di COC suini: una procedura per incapsulare complessi di ovociti cumulici in perle di idrogel polimerico di fibrina-alginato

In questo video, descriviamo un protocollo per l'incapsulamento di ovociti suini in microbioattori idrofobici.

Sistema microbioreattore in marmo liquido: un protocollo di coltura 3D per l'incapsulamento di ovociti suini

Questo protocollo descrive la coltura primaria / co-coltura di topo tessuto ovarico, con ovaie di topi neonati e singoli follicoli ovarici di topi prepuberi. Le tecniche di coltura supportano sviluppo in modo altamente fisiologico, consentendo studio dell'effetto di agenti estrinseci sulla ovaio, e di interazioni tra follicoli ovarici.

Cultura e co-coltura di mouse ovaie e follicoli ovarici

Qui presentiamo un adattamento del passivo chiarezza e metodo di ricostruzione 3D per la visualizzazione del vasculature ovarico e capillari follicolari nelle ovaie intatte del mouse.

Ricostruzione tridimensionale dell'architettura vascolare dell'ovaia passiva sdoganate per la chiarezza del Mouse

Qui presentati sono presentati due protocolli per l'incapsulamento di oociti di porcina in condizioni di coltura 3D. Nel primo, i complessi cumuli-oocici (COC) sono incapsulati in perline fibrin-alginate. Nel secondo, sono racchiusi con particelle di polvere di propilene di etilene fluorrinate (microbioreattori). Entrambi i sistemi garantiscono condizioni ottimali per mantenere la propria organizzazione 3D.

Idrogel alginato degradati proteolylylylyd e microbioreattori idrofobici per l'incapsulamento dell'Oocito Porcine

Questo protocollo descrive le metodologie per stabilire organoidi epiteliali endometriali di topo per l'espressione genica e le analisi istologiche.

Stabilire organoidi endometriali 3D dall'utero del topo

Questo protocollo descrive un nuovo modello di coltura tridimensionale (3D) che utilizza un idrogel di acido ialuronico legato alla tiramina per incapsulare e coltivare follicoli preantrali dall'ovaio di topo. Descriviamo anche due approcci alla crioconservazione del follicolo ovarico mediante vitrificazione.

Applicazione di un nuovo idrogel di acido ialuronico per la coltura tridimensionale dei follicoli e metodologia per la crioconservazione dei follicoli ovarici di topo

Descriviamo i metodi per coltivare i follicoli ovarici in un nuovo stampo di agarosio privo di scaffold che completa la gametogenesi in vitro .

Produzione e utilizzo di stampi di agarosio personalizzabili per la coltura di follicoli ovarici di topo senza scaffold

Descriviamo metodi per isolare cellule somatiche ovariche di topo da una frazione arricchita di stroma dell'ovaio e per generare organoidi somatici ovaricos di topo utilizzando un approccio senza impalcatura.

Indagine del microambiente ovarico: metodi per l'isolamento, la coltura 2D e la coltura organoide delle cellule somatiche ovariche del topo

Scopri la coltura tridimensionale di organoidi ovarici e tubarici in idrogeli di alginato. Questo metodo permette di studiare gli eventi iniziali della formazione del cancro ovarico mantenendo le caratteristiche cellulari native.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

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