Name: Immuno-fluorescenza saggio di Leptospiral superficie esposti Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Scopri un metodo di immuno-fluorescenza per valutare le proteine di superficie esposte di Leptospira mantenendo intatta la membrana esterna. Questa tecnica minimizza la manipolazione cellulare e include controlli negativi essenziali per risultati accurati.

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Questo studio è stato sostenuto dal Public Health Service concedere AI-34431 (a DAH) dell&#39;Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive e da Fondi VA Medical Research (a DAH).

1. Fissazione di Leptospira di vetrini <ol><li> Leptospira interrogans è una classe BSL2 patogeno. Lavorando con cellule vive che richiede una gestione appropriata, ad esempio i guanti, camice e fasi di pipettamento in una sterile-cappuccio. </li><li> Crescere Leptospira in EMJH medium11, integrato con siero di coniglio 1% a 30 ° C fino a raggiungere metà e la fine-log fase (densità di 5 x 10 7 a 5 x 10 8 cellule / ml) per circa 6 giorni. </li><li> Raccolta della cultura per centrifugazione a ~ 2000 xg per 7 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione e risospendere delicatamente il pellet in tampone fosfato (PBS) -5 mM MgCl 2, pH7.2 ad una concentrazione finale di 5 x 10 8 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 1 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di diapositive da camera a due ben vetro e incubare a 30 ° C per 80 min per consentire alle cellule di aderire. </li><li> Rimuovere con attenzione il liquido contenente cellule non legato per aspirazione. </li><li> Fissare i batteri rimasti intatti alle diapositive di vetro con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto del 2% paraformaldeide in PBS-5 mM MgCl 2. Incubare per 40 min a 30 ° C. Questi diapositive saranno per la valutazione della superficie esposta proteine. </li><li> Vetrini di controllo per valutare sotto la superficie delle proteine, la membrana esterna permeabilize fissando con 1 ml / pozzetto del 100% ghiacciata metanolo. Incubare a -20 ° C per 20 min. Metanolo agisce in diversi modi: si permeabilizes la membrana esterna, denaturates le proteine, e le cellule correzioni alle diapositive di vetro. </li><li> Rimuovere gli agenti di fissaggio mediante aspirazione. </li></ol> 2. Etichettatura con anticorpi specifici <ol><li> Blocca legame non specifico con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto di tampone di bloccaggio (Difco Leptospira arricchimento EMJH). Incubare a 30 ° C per 90 min. </li><li> Diluire l'anticorpo specifico (sieri immuni di coniglio o di anticorpi monoclonali di topo, coniglio qui sieri policlonali specifici per OmpL54 10, FlaA1 12 e OmpL1 13) e pre-immune coniglio ascetico sieri o il mouse fluido che non contengono anticorpi (quando utilizzati come controlli negativi) in tampone di bloccaggio. Diluizioni per ogni anticorpo devono essere determinati empiricamente a seconda del titolo anticorpale, antigene-anticorpo reattività e l'abbondanza di proteine ​​all'interno della cellula. La gamma usuale è 1:50 a 1:600. </li><li> Rimuovere il tampone di bloccaggio tramite aspirazione e aggiungere 1 ml / pozzetto di diluire gli anticorpi primari. </li><li> Incubare a 30 ° C per 1 ora. </li><li> Asportare il liquido mediante aspirazione e lavare i pozzetti tre volte con PBS (1 ml / pozzetto). </li></ol> 3. Visualizzazione delle leptospire <ol><li> Aggiungere 1 ml / pozzetto di Alexa Fluor 488-etichettati anticorpi secondari (o anti-rabbit IgG di capra o di capra anti-topo IgG) diluito 1:2000 e fluorescenti acido nucleico macchia, 4'6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato ( DAPI) diluito ad una concentrazione finale di 0,25 mg / ml in tampone di bloccaggio. Questo passaggio garantisce il rilevamento di legame degli anticorpi e la presenza di tutte le spirochete indipendente di legame degli anticorpi, rispettivamente. </li><li> Incubare i vetrini a 30 ° C per 45 min. </li><li> Asportare il liquido mediante aspirazione e lavare i pozzi due volte con PBS e una volta con acqua distillata (1 ml / pozzetto). </li><li> Rimuovere le camere e la striscia adesiva da vetrini e asciugare all'aria per circa 10 min. </li><li> Aggiungi prolungare oro anti-sbiadimento mezzo di montaggio (2 x 20 l per vetrino) e una x 24 50 vetrino mm. </li><li> Incubare per una notte a temperatura ambiente al buio. Questo passaggio è necessario per permettere al mezzo di montaggio per la cura (indurimento). </li><li> Sigillare il coprioggetto con smalto. </li><li> Visualizza la colorazione al microscopio a fluorescenza utilizzando un grigio-azzurro / blu rilevamento filtro DAPI e un filtro di rilevamento verde per Alexa Fluor 488. Per garantire che una rappresentazione accurata dei campioni è fatto, assicuratevi di valutare l'intera area della camera per ogni campione. </li><li> Registrare i dati da immagini di un campo rappresentante per ogni campione. Quando l'imaging Alexa Fluor 488 fluorescenza, utilizzare lo stesso tempo di esposizione per tutti i campioni. Usando un tempo coerente esposizione da consentire il confronto più accurato dei risultati con gli antigeni di test rispetto ai controlli. </li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: Esempi di risultati superficie IFA con le cellule Leptospira interrogans utilizzando anticorpi contro la superficie e sub-superficiali proteine ​​sono mostrati nella Figura 2. Un test è considerato positivo quando fluorescenza sostanziale viene rilevato in campioni con leptospire intatto per una proteina di interesse che è superficie esposta (fig. 2A). Di solito, in un test positivo (qui, superficie esposta OmpL54), circa lo stesso intensità di fluorescenza si osserva nelle cellule sia integro e permeabilizzate (Fig. 2A) È essenziale includere un controllo negativo per l'integrità della membrana esterna, utilizzando anticorpi contro un sottosuolo , preferibilmente periplasmatico proteine ​​(ad esempio leptospiral FlaA1, fig. 2B). Solo quando i dati mostrano che la membrana esterna è rimasta intatta during dell'esperimento, cioè di anticorpi contro un sub-superficiale di proteine ​​non reagiscono alle cellule intatte (non fluorescenza o fluorescenza molto più debole rispetto al campione permeabilizzate come in fig. 2B), si può concludere che la proteina (s) di interesse superficie esposta. L'inclusione degli esperimenti con pre-sieri immuni (nel caso degli anticorpi policlonali) come un ulteriore controllo negativo è essenziale per dati univoci e non deve cedere a fluorescenza sostanziale cellule intatte o permeabilizzate (Fig. 2A, 2C). Macchia DAPI è necessario per visualizzare leptospire quando i risultati negativi (nessun Alexa Fluor 488 fluorescenza) siano rispettate. Controcolorazione con ioduro di propidio è un'alternativa accettabile per DAPI. Questo metodo è qualitativa piuttosto che quantitativa come brillante fluorescenza può essere dovuto alla superficie più esposta epitopi antigenici essere riconosciuto in un singolo antigene rispetto a altri antigeni di abbondanza uguali ma con un minor numero di epitopi di superficie esposta. Pertanto le intensità di fluorescenza può essere utilizzato solo per confrontare la reattività degli anticorpi stessi, come le cellule intatte contro permeabilizzate e intensità di fluorescenza non tra proteine ​​diverse. Questa distinzione è importante quando un risultato ambiguo, dove si ottiene molto meno fluorescenza si osserva nelle cellule intatte che in cellule permeabilizzate (Fig. 2C). Tale risultato indica che la proteina è in una posizione sotto la superficie (con alcune non specifica colorazione di fondo delle cellule intatte), gli anticorpi sono vincolanti preferenzialmente a non nativi epitopi che sono esposti dopo permeabilizzazione metanolo o di una proteina potrebbe avere più siti di localizzazione, come descritto per le proteine ​​Erp e Elp di un altro spirocheta, Borrelia burgdorferi 14. In entrambi i casi, un risultato ambiguo IFA come questo richiede approcci alternativi come biotinilazione superficie o proteolisi superficie per determinare se la proteina di interesse superficie esposta o meno 10. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Diagramma di flusso per la superficie di immuno-fluorescenza saggio di Leptospira interrogans spirochete. In primo luogo, 1 ml di sospensione cellulare viene aggiunto in ciascun pozzetto della due-e diapositive da camera (almeno due vetrini per ogni esperimento) e incubate per leptospire di aderire. Successivamente, leptospire sono fissati alle diapositive da camera con l'aggiunta di 1 ml / pozzetto del 2% paraformaldeide (PFA) per i campioni con intatto membrana esterna (OM) e 1 ml / pozzetto del 100% metanolo freddo per i campioni con permeabilizzate OM. Successivamente, leptospire vengono incubati con gli anticorpi riconoscimento superficie esposta proteine ​​con anticorpi di controllo per le proteine ​​del sottosuolo (Primario Ab) a 30 ° C per 90 min. Poi, gli anticorpi primari sono rilevati mediante incubazione con 1 ml / pozzetto di Alexa Fluor 488 anticorpi secondari coniugati. Infine, le cellule vengono visualizzati al microscopio a fluorescenza. <img src="/files/ftp_upload/2805/2805fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un'analisi superficiale delle proteine ​​leptospiral immunofluorescenza. Leptospira interrogans spirochete sono stati sondati con sieri immuni e pre-immune, ed i risultati negativi sono stati accoppiati con un contrasto DAPI per dimostrare la presenza di spirochete. Una fluorescenza verde filtro è stato usato per rilevare Alexa Fluor 488 anticorpo marcato secondaria legame con le proteine ​​di superficie esposta e blu / grigio-azzurro fluorescenza filtro per rilevare legame al DNA delle cellule DAPI. A) leptospire sondato con anticorpi riconoscere una proteina di superficie esposta, OmpL54 10. B) Le cellule sondato con anticorpi contro una proteina periplasmatico sottosuolo, FlaA1 (controllo negativo). C) Le cellule sondato con anticorpi contro leptospiral porina, OmpL1. Vincolante di sieri di coniglio leptospire sono stati rilevati con Alexa Fluor 488 coniugato capra anti-coniglio frammenti di IgG. Tutte le immagini sono prese dopo 4 secondi di esposizione a lungo.

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<li>Parveen, N., Leong, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+candidate+glycosaminoglycan-binding+adhesin+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi.</a> Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).</li>
<li>Ristow, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+OmpA-like+protein+Loa22+is+essential+for+leptospiral+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence.</a> PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La nostra tecnica IFA superficie è simile a quello utilizzato per dimostrare l&#39;esposizione superficie di vari borrelial 15, 16 e leptospiral 12, 17 proteine. I dettagli del metodo superficie IFA qui descritti sono stati progettati per ridurre al minimo la manipolazione di cellule, nel tentativo di mantenere l&#39;integrità della membrana esterna sfruttando la tendenza delle cellule Leptospira di aderire alle diapositive di vetro. Il metodo prevede una concentrazione più bassa (2% versus 4%) di ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Due pozzetti camera di vetrini </td><td> Lab-Tek </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di coniglio </td><td> Rockland Immunochemicals </td><td> D209-00-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Leptospira arricchimento EMJH </td><td> BD Difco </td><td> 279510 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 di capra anti-IgG di coniglio (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11034 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG (H + L) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> A-11029 </td><td></td></tr><tr><td> 4&#39;6-diamidino-2-fenil-indolo dicloridrato (DAPI) </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare oro anti-sbiadimento mezzo di montaggio </td><td> Invitrogen / Molecular Probes </td><td> P36930 </td><td> A temperatura ambiente prima dell&#39;uso </td></tr><tr><td> Fisherfinest Premium di vetro di copertura </td><td> Pescatore </td><td> 12-544-14 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> Axioskop 40 </td><td></td></tr></tbody></table>

immuno-fluorescenza saggio di leptospiral superficie esposti proteine

Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins

Proteine ​​della superficie batterica sono coinvolti in contatto diretto con le cellule ospiti e l&#39;assorbimento delle sostanze nutritive dall&#39;ambiente 1. Per questo motivo, localizzazione cellulare in grado di fornire intuizioni sul ruolo funzionale delle proteine ​​batteriche. Localizzazione superficiale delle proteine ​​batteriche è un passo fondamentale verso l&#39;identificazione dei fattori di virulenza coinvolti nei meccanismi di patogenicità. Metodi per frazionamento leptospiral 2-5 membrane può essere selettivo per una certa classe di proteine ​​di membrana esterna (OMP), come lipoproteine ​​vs OMP transmembrana, e quindi portare a errata classificazione. Questo probabilmente è dovuto a differenze strutturali e come essi sono associati alla membrana esterna. Le lipoproteine ​​sono associati alle membrane attraverso una interazione idrofobica tra N-terminale porzione lipidica (tre acidi grassi) e dei fosfolipidi doppio strato lipidico 6, 7. Al contrario, OMP transmembrana sono tipicamente integrate nel doppio strato lipidico da anfipatiche β-fogli disposti in una botte struttura simile 8, 9. Inoltre, la presenza di una proteina nella membrana esterna non garantisce necessariamente che la proteina oi suoi domini sono esposte sulla superficie. Spirochete membrane esterne sono noti per essere i metodi fragile e occorre, pertanto coinvolgono la manipolazione dolce delle cellule e l&#39;inclusione di sub-superficie proteina controlli per valutare l&#39;integrità della membrana esterna. Qui, presentiamo una immunofluorescenza saggio (IFA) per valutare direttamente l&#39;esposizione di proteine ​​sulla superficie leptospire intatto. Questo metodo si basa sul riconoscimento delle proteine ​​di superficie leptospiral da antigene-anticorpi specifici. Qui, gli anticorpi specifici per OmpL54 10 sono detetcted aftero vincolanti per natale, epitopi superficie esposta. Confronto di reattività anticorpi contro le cellule intatte permeabilizzate consente la valutazione della distribuzione cellulare e se non è selettivo una proteina presente sulla superficie leptospiral. L&#39;integrità della membrana esterna deve essere valutato utilizzando anticorpi ad una o più proteine ​​del sottosuolo, preferibilmente situato nel periplasma. Il metodo IFA superficie può essere utilizzato per analizzare l&#39;esposizione superficie di qualsiasi proteina leptospiral a cui gli anticorpi specifici sono disponibili. Sia l&#39;utilità e la limitazione del metodo dipende dal fatto che gli anticorpi utilizzati sono in grado di legarsi agli epitopi nativi. Dal momento che gli anticorpi sono spesso sollevate contro proteine ​​ricombinanti, di epitopi nativi, superficie esposta proteine ​​potrebbe non essere riconosciuto. Tuttavia, il metodo superficie IFA è uno strumento prezioso per lo studio delle componenti intatte superfici batterica. Questo metodo può essere applicato non solo per leptospire, ma anche spirochete e altri batteri gram-negativi. Per i più forti conclusioni sulla superficie-esposizione di OMP, un approccio globale che coinvolga diversi metodi di localizzazione delle cellule si consiglia 10.

Un metodo efficace per valutare l&#39;esposizione superficiale di proteine ​​leptospiral è descritto. Il metodo è specificamente progettato per evitare l&#39;interruzione della membrana esterna delle cellule fragili leptospiral. Questa tecnica richiede l&#39;impiego di diversi controlli negativi per valutare l&#39;integrità della membrana esterna e la specificità della reazione anticorpale.

Immuno-fluorescenza saggio di Leptospiral superficie esposti Proteine

Le proteine di superficie batteriche sono coinvolte nel contatto diretto con le cellule ospiti e nell'assorbimento di nutrienti dall'ambiente 1. Per questo motivo, l'analisi cellulare...

Le proteine di superficie batteriche entrano in contatto diretto con le cellule dell'ospite e sono coinvolte anche nell'assorbimento di nutrienti dall'ambiente. Pertanto, la localizzazione sulla superficie di proteine batteriche rappresenta un passaggio fondamentale per l'identificazione di fattori di virulenza. In questo studio, viene presentato un metodo per valutare l'esposizione in superficie di proteine su leptospire intatte, in confronto con saggi di immunofluorescenza precedentemente descritti.I dettagli del metodo qui descritto sono progettati per ridurre al minimo la manipolazione delle cellule al fine di mantenere l'integrità della membrana esterna. In primo luogo, una sospensione di leptospire viene aggiunta a vetri camera in vetro. I vetri vengono incubati per consentire alle cellule di aderire; le leptospire aderenti vengono quindi fissate con paraformaldeide al 2% per preservare una membrana esterna integra durante la valutazione delle proteine di superficie, oppure con metanolo al 100% per permeabilizzare la membrana esterna e rivelare le proteine sottostanti.Gli spirochete fissati vengono quindi marcati con anticorpi specifici e visualizzati mediante anticorpi secondari marcati a fluorescenza. Le proteine localizzate sulla superficie possono essere marcate e osservate in cellule integre e permeabilizzate, mentre le proteine sottosuperficiali possono essere osservate solo in cellule permeabilizzate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della patogenesi microbica, ad esempio se una proteina è localizzata sulla superficie batterica, dove può svolgere un ruolo nelle interazioni tra patogeno e ospite.Il metodo qui presentato è stato ideato per ridurre al minimo la manipolazione delle cellule, il che dovrebbe contribuire a mantenere integra la membrana. Questo metodo prevede una concentrazione inferiore di agente fissante, un lavaggio con tampone stabilizzante per la membrana e un numero ridotto di passaggi di lavaggio rispetto ai saggi descritti in precedenza. Inoltre, il nostro metodo di immunofluorescenza di superficie sottolinea l'importanza di controlli positivi e negativi, essenziali per un'interpretazione accurata dei dati.La procedura sarà dimostrata dalla dott.ssa Maria Pinney, un'aspirante ricercatrice del mio laboratorio. Leptospira interrogans è un agente patogeno di livello di sicurezza biologica 2 (BSL 2). Il lavoro con cellule vive richiede un'adeguata manipolazione e precauzioni.È necessario indossare sempre camice da laboratorio e guanti. Tutte le operazioni di pipettaggio e/o di manipolazione di contenitori aperti contenenti cellule vive devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare. Coltivare leptospira in mezzo EMJH integrato con siero di coniglio al 1% a 30 gradi Celsius, quando i batteri hanno raggiunto la fase logaritmica media o tardiva.Circa sei giorni dopo, raccogliere la coltura mediante centrifugazione a 2000 ×g per sette minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il soprannatante per aspirazione e risospendere delicatamente il pellet in PBS contenente cloruro di magnesio 5 millimolare fino a una concentrazione finale di 5 × 10⁸ cellule per millilitro. Successivamente, aggiungere a ciascun pozzetto di due vetri portaoggetto con camere. Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare qui. Per ogni saggio delle proteine di superficie vengono preparati un vetrino di prova e un vetrino di controllo, con il secondo pozzetto utilizzato per i controlli come mostrato qui; incubare a 30 gradi Celsius per consentire alle cellule di aderire. Dopo 80 minuti, aspirare con attenzione il liquido per rimuovere le cellule non legate dai vetrini di prova, che verranno utilizzati per valutare le proteine esposte sulla superficie.Aggiungere un millilitro per pozzetto di paraformaldeide al 2% in PBS con cloruro di magnesio 5 millimolare per fissare i batteri rimanenti intatti al vetrino. Incubare per 40 minuti a 30 gradi Celsius i vetrini di controllo, che verranno utilizzati per valutare le proteine sottostanti. Fissare le cellule e permeabilizzare la membrana esterna aggiungendo un millilitro di metanolo al 100% ghiacciato in ogni pozzetto.Il metanolo permeerà la membrana esterna, denaturerà le proteine e fisserà le cellule al vetro. Incubare i vetrini a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Aspirare gli agenti di fissazione dopo la fissazione.Le cellule non sono più vitali e non è necessario manipolarle in una cappa a sicurezza biologica. Per etichettare i batteri con anticorpi specifici, iniziare aggiungendo un millilitro di buffer bloccante in ogni pozzetto su tutti i vetrini per bloccare il legame non specifico. Incubare a 30 gradi Celsius per 90 minuti.Durante l'incubazione, diluire l'anticorpo primario nel buffer di blocco. Gli anticorpi utilizzati in questo caso sono diretti contro proteine di Leptospira interrogans. L'anticorpo MPL 54 riconosce una proteina della membrana esterna esposta sulla superficie, di 54 chilodalton.L'anticorpo anti flat A uno riconosce la subunità A del gellano periplasmatico e l'anticorpo anti OL uno riconosce la poin leptospirale, che è una proteina della membrana esterna. Preparare anche controlli negativi diluendo sieri di coniglio pre-immune o liquido ascitico murino privo di anticorpi nel buffer di blocco. Dopo un'incubazione di 90 minuti, rimuovere il buffer di blocco per aspirazione e aggiungere un millilitro di anticorpi primari diluiti o sieri di controllo in ogni pozzetto, quindi incubare a 30 gradi Celsius per un'ora.Rimuovere il liquido per aspirazione e lavare i pozzetti tre volte con PBS, aggiungere un millilitro di anticorpi secondari marcati con LOR 4 88 a ciascun pozzetto e il colorante nucleico fluorescente DPI diluito nel buffer di blocco. Questo passaggio garantisce rispettivamente la rilevazione del legame degli anticorpi e la presenza di tutti i treponemi, indipendentemente dal legame anticorpale. Incubare i vetrini a 30 gradi Celsius per 45 minuti.Rimuovere il liquido per aspirazione e lavare i pozzetti due volte con PBS e una volta con acqua distillata, quindi rimuovere le camere e la striscia adesiva dai vetrini. Lasciare asciugare i vetrini all'aria per circa 10 minuti. Aggiungere 20 microlitri di mezzo di montaggio anti-sfaldamento prolonged gold per ogni campione sul vetrino.Quindi posizionare un coprioggetto da 24 per 50 millimetri e incubare tutta la notte a temperatura ambiente al buio. Questo passaggio è necessario per consentire al mezzo di montaggio di polimerizzare. Il giorno successivo.Sigillare il vetrino con smalto per unghie. Visualizzare la colorazione mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un filtro di rilevamento ciano o blu per DPI e un filtro di rilevamento verde per LOR 4 88. Per garantire una rappresentazione accurata dei campioni, assicurarsi di valutare l'intera area della camera per ciascun campione.Registrare i dati acquisendo un'immagine di un campo rappresentativo per ogni campione. Quando si acquisisce la fluorescenza di exor 4 88, utilizzare lo stesso tempo di esposizione per tutti i campioni. L'uso di un tempo di esposizione costante permetterà un confronto più accurato dei risultati tra antigeni in prova e controlli.Assicurarsi di valutare l'intera area della camera per ogni campione prima di trarre conclusioni sulla superficie. È stata eseguita un'analisi di immunofluorescenza per valutare l'esposizione superficiale di MPL 54 in Leptospira inters. Come mostrato qui, è stato rilevato un forte segnale di fluorescenza.Questo segnale era assente nelle cellule incubate con sieri pre-immune, ma rimaneva costante nelle cellule permeabilizzate. Se la proteina è localizzata sulla superficie, si rileverà un'intensa fluorescenza nelle cellule intatte. Se la proteina è sottosuperficiale, sarà rilevata soltanto nelle cellule permeabilizzate, di solito in un test positivo.Un'intensità di fluorescenza approssimativamente uguale viene osservata sia nelle cellule integre che in quelle permeabilizzate. Quando le cellule non permeabilizzate sono state incubate con la proteina sottostante in forma piatta, non è stata osservata alcuna colorazione, indicando che la membrana esterna è rimasta integra durante l'esperimento. Pertanto, si può concludere che ML 54 è esposta sulla superficie quando si osserva una fluorescenza significativamente inferiore nelle cellule integre rispetto alle cellule permeabilizzate.O il proteina si trova in una posizione sub-superficiale con una certa colorazione di fondo non specifica delle cellule integre, oppure gli anticorpi si legano preferenzialmente a epitopi non nativi esposti dopo la permeabilizzazione con metanolo. In entrambi i casi, un risultato ambiguo come questo richiede approcci alternativi, come la biotinilazione superficiale o la proteolisi superficiale, per determinare se la proteina è esposta sulla superficie o meno. Durante il tentativo di questa procedura, è importante includere un numero sufficiente di controlli per assicurarsi che la membrana alterata sia rimasta integra.Questi controlli includono siero metanolo premium, cellule permeabilizzate e antisiero contro le proteine sottostanti.

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