Un metodo rapido per High-Resolution Imaging di fluorescenza in semi-spessa fettine di cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare più facilmente i neuroni fluorescenti all'interno di sezioni cerebrali spesse. Questo risultato si ottiene innanzitutto inserendo il cervello in un supporto per tappi aeros. Il secondo passaggio della procedura consiste nel sezionare il cervello in fette spesse utilizzando il tomografo compresso.

Il terzo passaggio della procedura consiste nel chiarire otticamente le sezioni cerebrali in un gradiente di glicerolo. L'ultimo passaggio della procedura è il montaggio delle sezioni cerebrali chiarite su vetrini per l'analisi mediante microscopia fluorescente. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano un'espressione di reporter proteici fluorescenti ad alta risoluzione nei neuroni all'interno di sezioni cerebrali spesse, mediante microscopia epifluorescente o microscopia confocale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la sezione sottile, la microscopia fluorescente in serie o l'imaging a fotoni multipli è che essa è molto più rapida, richiede meno lavoro ed evita l'uso di tecniche microscopiche costose o sofisticate. Per iniziare, recuperare il tessuto cerebrale di topo sottoposto a fissazione NC mediante perfusione cardiaca e postfissato per uno o due ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, preparare una soluzione al 2% di agarosio ad alta resistenza e basso punto di gelificazione in PBS e riscaldare al microonde fino a completa dissoluzione.

Trasferire l'agarosio fuso in una provetta e posizionarla in un blocco termoregolato a 40 gradi Celsius per stabilizzare la temperatura, mentre si incolla il tessuto cerebrale fissato sullo stantuffo della siringa per campioni. Con colla Sano Aate, immergere il tessuto montato in una soluzione satura di saccarosio in PBS per ricoprire la superficie del cervello, quindi arretrare lo stantuffo all'interno del corpo della siringa. Pipettare l'agarosio caldo nello stantuffo, coprendo completamente il tessuto cerebrale e facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria.

Infine, fissare la siringa del campione con un blocco refrigerante freddo per circa un minuto. Per impostare gli aros, assemblare la siringa del campione contenente il tessuto cerebrale incorporato nel compressore domestico. Allineare attentamente il bordo della lama con l'uscita della siringa del campione, quindi riempire il serbatoio del buffer con PBS.

Ruotare il micrometro. Procedere in avanti con lo spessore della sezione per estrudere il tessuto cerebrale inclusato dalla siringa del campione. Per generare la prima sezione, premere il pulsante di avvio sull'unità di controllo.

Ripetere il processo di avanzamento del tessuto inclusi e premere il pulsante di avvio per generare il numero desiderato di sezioni. Raccogliere le sezioni con una pipetta di trasferimento e trasferirle in un vial di vetro riempito con PBS; rimuovere con la pipetta la maggior parte del PBS dalle sezioni raccolte e sostituirlo con una soluzione di glicerolo al 10% in PBS. Agitare delicatamente il vial a quattro gradi Celsius su un agitatore rotante da banco fino a quando le sezioni affonderanno.

Proseguire la chiarificazione graduale ripetendo il processo di decantazione e riempimento con soluzioni di glicerolo al 25, al 50 e poi al 75%. Aspirare con la pipetta la soluzione di glicerolo al 75% e sostituirla con glicerolo al 90%. Avere cura di non introdurre bolle d'aria ed equilibrare a quattro gradi Celsius con un movimento delicato di oscillazione.

Ora che le sezioni sono state completamente chiarite, non affonderanno più, ma mostreranno una galleggiabilità neutra. Tagliare un adesivo doppio lato a forma di rettangolo aperto con un bordo di due-tre millimetri, in modo che si adatti all'area visibile di un vetrino microscopico da 25 per 75 millimetri, utilizzando una pinzetta. Disporre le sezioni cerebrali entro il bordo sul vetrino.

Abbassi delicatamente il vetrino coprioggetto sul nastro adesivo. Facendo attenzione a non introdurre bolle d'aria, applichi una leggera pressione per sigillare ed aspiri qualsiasi eccesso di glicerolo; quindi sigilli i bordi del vetrino applicando dello smalto trasparente. Una volta che la sigillatura è asciutta, il vetrino può essere conservato in una scatola per vetrini a quattro gradi Celsius oppure sottoposto ad imaging.

Utilizzare immediatamente la microscopia a fluorescenza episcopica. Il pattern di espressione di un vettore virale che esprime la GFP migliorata può essere osservato in una sezione coronale di tessuto cerebrale di topo spessa 200 micrometri. Qui, l'area evidenziata nell'immagine a fluorescenza episcopica è mostrata ad alta risoluzione mediante microscopia confocale per rivelare singoli neuroni corticali dello strato cinque.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare sezioni cerebrali spesse fissate per un'analisi fluorescente rapida e ad alta risoluzione.