Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'assorbimento di nanoparticelle nei tumori mediante imaging intra vitale. Ciò si ottiene innanzitutto rimuovendo il guscio ed eseguendo la coltura di embrioni aviani. Il secondo passaggio consiste nell'indurre tumori xenotrapiantati nella membrana corioallantoidea, o CAM, e lasciarli crescere per circa una settimana.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'iniettare per via endovenosa nanoparticelle nel cam e nell'eseguire un'immagine confocale intravitale in tempo reale del tumore xenotrapiantato. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'escissione e la sezione del tumore. Infine, l'assorbimento delle nanoparticelle da parte del tumore viene quantificato a partire dalle immagini e può essere effettuata un'analisi secondaria del tumore.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente di ottenere immagini ad alta risoluzione per valutare la dinamica dell'accumulo di nanoparticelle nei tumori a livello microscopico. Inoltre, utilizzando questo sistema modello, un singolo ricercatore può analizzare un numero molto elevato di gruppi sperimentali entro due settimane. In aggiunta, la membrana corioallantoidea degli embrioni di Shells è facilmente accessibile per manipolazioni fisiche e per imaging non invasivo.

Il mio laboratorio si concentra sullo sviluppo di nanoparticelle per l'imaging molecolare mirato e il rilascio mirato di farmaci nel cancro. La nostra ricerca di un modello xenoinnestrato rapido ed economico in cui eseguire analisi dettagliate dell'assorbimento ci ha portati a utilizzare l'embrione di pollo con guscio. In questo studio, impieghiamo un imaging intravitale ad alta risoluzione per valutare l'assorbimento di nanoparticelle in xenoinnesti tumorali umani mediante un modello modificato di embrione di pollo con guscio.

Per questo protocollo, preparare ed espiantare embrioni di pollo fecondati al quarto giorno. Utilizzando il metodo standard, verificare che gli embrioni siano fecondati e vitali controllando la presenza di un battito cardiaco e incubarli a 38 gradi Celsius con un'umidità relativa di almeno il 60% fino al nono giorno embrionale, quando gli embrioni saranno pronti per l'inoculazione delle cellule tumorali.

Assemblare un microiniettore collegando un ago da 18 gauge a una siringa da un millilitro mediante un pezzo di tubo in teflon lungo da cinque a sei pollici. Inserire con attenzione il bisellato dell'ago nel tubo. Dalla punta dell'ago dovrebbe sporgere un tratto di tubo lungo circa quattro o cinque pollici.

Ora, aspirare la sospensione di cellule tumorali attraverso il tubo nella siringa e capovolgerla. Toccare delicatamente il lato della siringa e premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, inserire un ago di vetro per microiniezione all'estremità del tubo e premere lo stantuffo finché la sospensione cellulare non raggiunge la punta dell'ago.

Ora, sotto un microscopio stereoscopico, iniettare lentamente e con attenzione da 10.000 a 100.000 cellule tumorali nello spazio interstiziale all'interno della cam. Le cellule dovrebbero formare un bolus visibile all'interno della cam; le cellule depositate sulla superficie della cam possono essere rimosse tamponando leggermente con un fazzoletto in tessuto non tessuto (kim wipe) o un bastoncino di cotone. A questo punto, reinserire gli embrioni in un incubatore a 38 gradi Celsius con un'umidità di almeno il 60%.

Ha permesso al tumore di crescere e sviluppare vascolarizzazione fino a sette giorni, raggiungendo un diametro di almeno cinque millimetri prima dell'imaging. Le nanoparticelle devono essere marcate con un colorante fluorescente compatibile con il microscopio intravitale e conservate a quattro gradi Celsius in PBS, dove rimangono stabili per almeno un anno. Successivamente, centrifugare le nanoparticelle per un minuto per formare un pellet ed eliminare eventuali aggregati prima di caricarle nell'iniettore microscopico. Ora, utilizzando PBS per diluire le nanoparticelle, preparare una concentrazione lavorativa di un milligrammo per millilitro, al fine di iniettare 50 microgrammi di nanoparticelle in un volume di 50 microlitri.

Ora procedere con le iniezioni al giorno 16 dello sviluppo embrionale. Verificare che i tumori siano sufficientemente vascolarizzati per selezionare i migliori embrioni portatori di tumore per via endovenosa. Iniettare una destrina fluorescente a basso peso molecolare, spettralmente distinta dalle cellule tumorali e dalle nanoparticelle.

Quindi, visualizzare la destrina al microscopio a fluorescenza e selezionare gli embrioni con tumori più vascolarizzati. Una volta selezionati gli embrioni, utilizzare un microiniettore preparato per aggiungere almeno 200 microlitri dei nanoparticelle preparate. Capovolgere la siringa.

Battere leggermente sul fianco e premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria. Inserire ora un lungo ago microiniettore in vetro con punta affusolata all'estremità del tubo e premere lo stantuffo finché la soluzione di nanoparticelle non raggiunge la punta dell'ago. Un ago smussato non riesce a penetrare nell'ectoderma, mentre un ago eccessivamente appuntito e sottile si romperà durante l'inserimento nel tessuto.

Successivamente, iniettare per via endovenosa da 30 a 200 microlitri di nanoparticelle negli embrioni, lontano dal lato desiderato da visualizzare immediatamente dopo l'iniezione delle nanoparticelle. I tumori, come descritto nella prossima sezione, iniziano preparando l'unità di imaging per l'embrione. Applicare innanzitutto uno strato sottile di grasso da vuoto lungo la circonferenza del portello di imaging sulla parte inferiore del coperchio.

Quindi applicare un coperchio di vetro da 18 millimetri sul portello. Ora caricare l'embrione nell'unità in modo che il coperchio di vetro sia sopra l'area desiderata per l'acquisizione delle immagini. Abbassare lentamente il coperchio dell'unità finché il coperchio di vetro non entra appena a contatto con l'embrione e fissare il coperchio in posizione con le viti.

Ora riempire la piastra contenente l'embrione con acqua a 37 gradi Celsius nell'unità di acquisizione immagini. Questa unità manterrà l'embrione in posizione sotto il microscopio confocale a disco rotante al microscopio a fluorescenza confocale a disco rotante. Verificare che la camera ambientale sia a 37 gradi Celsius.

Ora, posizionare l'unità di acquisizione immagini sul palchetto in modo che la finestrella del vetrino sia direttamente sotto l'obiettivo del microscopio ed eseguire l'acquisizione delle immagini. Acquisire serie di immagini ad alta risoluzione del tumore e della vascolarizzazione circostante immediatamente dopo l'iniezione e a intervalli orari.

In seguito, le immagini rifletteranno dettagliate modifiche strutturali che si verificano nella vascolarizzazione tumorale. L'embrione può essere osservato in modo continuo per un periodo fino a 36 ore senza necessità di cambiare il bagno d'acqua. Per quantificare l'assorbimento di nanoparticelle virali a partire dalle immagini, utilizzare un pacchetto software come velocity.

Per prima cosa, selezionare il tumore e delimitarlo dallo stroma circostante. La selezione è facilitata etichettando il tumore con destrina fluorescente. Calcolare ora il segnale fluorescente medio proveniente dalle nanoparticelle nel tumore e in aree rappresentative dello stroma adiacente.

Successivamente, calcola il rapporto del segnale medio. Rafforza la selezione del tumore rispetto al segnale medio. Rafforza la selezione dello stroma.

Un rapporto maggiore di uno indica che le nanoparticelle sono localizzate preferenzialmente nel tumore. Le cellule di cancro del colon HT29 sono state iniettate per formare un bolus di circa un millimetro di diametro all'interno della membrana corioallantoidea al nono giorno. Gli embrioni di pollo, dopo sette giorni di incubazione, sono stati iniettati per via endovenosa con una destrina a basso peso molecolare per confermare la vascolarizzazione del tumore.

L'amministrazione endovenosa di nanoparticelle di CPMV LOR 6 47 o di CPMV LOR 6 47 pegilato, seguita da un'immagine confocale in tempo reale ad alta risoluzione, ha rivelato che sia le nanoparticelle di CPMV che quelle di CPMV pegilato etichettano rapidamente l'intera vascolarizzazione. Entro 12 ore dall'iniezione, la quantificazione del segnale fluorescente nelle regioni tumorali rispetto a quelle del stroma ha mostrato che l'assorbimento del CPMV pegilato nel tumore era circa tre volte superiore rispetto a quello del CPMV. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'immagine intravitale ad alta risoluzione per valutare l'assorbimento di nanoparticelle in xenotrapianti tumorali in un modello di embrione aviario, dalla preparazione degli embrioni aviari al trapianto di cellule tumorali, dall'iniezione endovenosa di nanoparticelle alla valutazione dell'assorbimento delle nanoparticelle nei tumori mediante imaging confocale intravitale in tempo reale.