Name: Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Scopri come quantificare la captazione di nanoparticelle nei tumori utilizzando imaging intravitale in tempo reale su embrioni aviari. Questo metodo consente analisi ad alta risoluzione della dinamica vascolare tumorale.

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Questo studio è stato supportato da CCSRI di Grant # 700537 e CIHR Concessione # 84535 di JDL e NIH / NCI concedere # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 ad AZ. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti e linee guida della cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale presso la University of California di San Diego, cura degli animali e Usa presso la University of Western Ontario.

1. Inoculazione di tumore in CAM embrione aviaria <ol><li> Preparare conchiglia meno embrioni di pollo fecondate, come descritto 8. </li><li> Il 9 ° giorno di sviluppo embrionale, assemblare un micro-iniettore con un 18-gauge collegato su siringa da 1 ml. Tagliare un pezzo di 5-6 centimetri di tubo Tygon (1 / 32 "di diametro interno, 3 / 32" di diametro esterno, 1 / 32 "spessore della parete) e inserire con cautela bisello dell'ago nel tubo. Circa 4-5 cm di tubo dovrebbe si estendono dalla punta dell'ago (figura 1a). </li><li> Riempire la siringa e il tubo con la sospensione cellulare. Quindi, inserire un ago di vetro microiniezione alla fine del tubo e con attenzione rimuovere eventuali bolle d'aria. </li><li> Iniettare Giorno 9 embrioni (figura 1b) in un ambito di dissezione con un illuminatore con 10,000-100,000 cellule del cancro come un bolo all'interno del CAM (Figura 1c). Iniettare lentamente e con attenzione le cellule in modo che l'ago è nel posto giusto per le cellule di formare un bolo visibile all'interno della CAM. Le cellule che a goccia sulla superficie CAM può essere pulito con applicatore Kimwipe o altro. </li><li> Ritorna embrioni incubatore umidificato a 38 ° C al 60% di umidità e permettere tumore di crescere e vascolarizzano (fino a 7 giorni). </li></ol> 2. Preparazione di nanoparticelle <ol><li> Per preparare fluorescente nanoparticelle CPMV per l'iniezione in embrione di pollo; diluire le nanoparticelle virale (come sintetizzato in 8 in PBS, pH 7,4, ad una concentrazione di 100 mg / ml miscela Vortex bene prima dell'uso e centrifugare per un minuto di togliere qualunque. aggregati. sonicazione può essere utile anche a seconda coniugati e il grado di aggregazione. Stock di CPMVs fluorescente sono stabili per almeno 1 anno se conservato a 4 ° C al buio. Controllare periodicamente le scorte da mettere un paio di gocce su un vetrino e controllo per fluorescenza. microscopia elettronica a trasmissione (TEM) può essere utilizzato anche per determinare se le particelle rimaste intatte dopo coniugazione. </li><li> In breve, un microgrammo di nanoparticelle virale (in un volume finale di 2 mL) possono essere aggiunti alle reti in rame rivestito. Successivamente, aggiungere un uguale volume di acetato di uranile 2% per 1 minuto al microscopio elettronico (Philips EM 410). </li></ol> 3. Iniezione endovenosa di fluorescenza marcata con nanoparticelle virale <ol><li> Il Giorno 16, assemblare micro-iniettore come descritto sopra. Redigere il volume desiderato di nanoparticelle virale attraverso il tubo nella siringa (&gt; 200 mL). Rimuovere con attenzione eventuali bolle d'aria. Inserire l'ago di vetro microiniezione alla fine del tubo. Assicurarsi che l'ago è lungo e affusolato possibile (Figura 2a). Se l'ago è troppo schietto, non sarà in grado di penetrare l'ectoderma e non riuscirà a penetrare il vaso. Se l'ago è troppo forte, la punta crollerà quando penetrare nei tessuti. </li><li> Per via endovenosa iniettare 100 ml di 1 mg / ml di fluoresceina destrano (70.000 MW Da, Invitrogen) in embrione cuscinetto tumore distale dal sito desiderato da visualizzare (Figura 3d). Cannulazione successo della vena CAM è evidente dalla compensazione di sangue nel percorso del flusso di iniezione (Figura 2b). Valutare vascolare perdita 1 ora dopo l'iniezione. </li><li> Iniettare per via endovenosa 50 ml di 1 mg / ml di soluzione di CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV AF-647) o pegilato CPMV-Alexa Fluor 647 (CPMV-PEG-AF 647) in embrioni contenenti i tumori con perdite vascolari distali dal sito desiderato essere visualizzati. </li><li> Tumori immagine subito e ogni ora dopo l'iniezione utilizzando un microscopio Zeiss Examiner Z1 verticale dotata di un disco di Yokogawa filatura, Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD. </li></ol> 4. In tempo reale intravitale di imaging <ol><li> Per assemblare l'unità di riproduzione embrione, applicare un sottile strato di grasso per vuoto attorno alla circonferenza del porto di imaging sul lato inferiore del coperchio della fotounità embrione, e si adattano a 18 mm di vetro coprioggetto sul porto. </li><li> Posizionare l'embrione in modo che il coprioggetto coprirà l'area desiderata per l'imaging. Abbassare lentamente il coperchio fino a quando il coprioggetto fa solo contatto con l'embrione, e quindi avvitare il coperchio sull'unità per tenerlo in posizione (Figura 2c). </li><li> Aggiungere acqua riscaldata a 37 ° C all'interno dell'unità embrione di imaging fuori del piatto che contiene l'embrione, e poi si porta il complesso sulla scena di un microscopio confocale verticale con la camera interna ambientali equilibrati a 37 ° C. </li><li> Posizionare l'unità di riproduzione che contiene l'embrione sotto il microscopio a fluorescenza Spinning disco confocale (Figura 2 sexies). L'unità imaging terrà l'embrione al suo posto e tenere il campo visivo durante l'acquisizione di immagini fisse, consentendo sia tridimensionale stack Z e time-lapse immagini da catturare. Noi acquisire e analizzare tridimensionale time-lapse immagini utilizzando Perkin Elmer (ex Improvvisazione) pacchetto software Volocity (Figura 3a). Acquisire ad alta risoluzione tridimensionale pila di vascolarizzazione del tumore e circostanti per visualizzare detailed analisi strutturale a specifici tempi punti. Acquisire tridimensionale pile a intervalli regolari di tempo i punti di mappa dettagliata dei cambiamenti strutturali nel sistema vascolare del tumore. Tumori immagine ogni ora dopo l'iniezione. </li><li> Quantificare l'assorbimento delle nanoparticelle virale calcolando la media Alexa Fluor (AF) 647 del segnale all'interno di regioni selezionate nel tumore o nello stroma (non tumorali zona) software per immagini utilizzando la quantificazione come Volocity (Perkin Elmer). Il tumore al rapporto stroma è stato calcolato dividendo la media AF 647 segnale nel tumore oltre la media AF 647 segnale nello stroma. Un tumore / stroma rapporto superiore a 1 indica che la nanoparticella è stato preso dal tumore. </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Nell'esempio qui descritto, abbiamo iniettato le cellule HT-29 cancro al colon a formare un bolo di circa 1 mm di grandezza entro il giorno 9 CAM di embrioni di pollo (Figura 1b). Dopo l'inoculazione, gli embrioni sono stati coltivati ​​per 7 giorni in un incubatore umidificato per consentire una crescita sufficiente e la vascolarizzazione del tumore (Figura 1c). Gli embrioni sono stati iniettati per via endovenosa con un peso di destrano a basso molecolare per confermare vascolarizzazione del tumore, ei tumori sono stati visualizzati al microscopio Zeiss AxioExaminer Z1 verticale (Figura 2d). Dopo somministrazione endovenosa di CPMV-AF 647 o CPMV-PEG-AF 647 nanoparticelle (Figura 3a e b), ad alta risoluzione in tempo reale di imaging confocale (Figura 2 sexies) ha rivelato che sia CPMV e CPMV-PEG nanoparticelle rapidamente etichettato l'intero sistema vascolare, ma l'assorbimento di CPMV-PEG da parte del tumore è stata di circa 3 volte superiore CPMV dopo 12 ore (Figura 3a). L'assorbimento relativo di tumore nanoparticelle è stata determinata utilizzando software per l'analisi dell'immagine (Volocity da Perkin Elmer). Regioni di interesse sono stati selezionati all'interno e all'esterno del tumore (nel vano stromali) e l'intensità media di fluorescenza di ogni stato determinato. I dati vengono espressi come tumore / stroma rapporto. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Microiniezione dei tumori nel CAM di un embrione aviaria. (A) L'apparecchio microiniezione viene assemblata dai componenti, come indicato. (B) gli embrioni aviaria al giorno 9 sono pronti per essere inoculati con tumore quando la CAM si è diffusa per coprire l'intera superficie. (C) Al giorno 16, il tumore è cresciuto fino a 1 cm di diametro (linea tratteggiata) ed è pronto per l'iniezione di nanoparticelle. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Iniezione di nanoparticelle e di imaging intravitale. Iniezione sotto un microscopio che mostra la dissezione (a) la punta dell'ago microinjector pronto per essere iniettato nella vena CAM e (b) l'ago microinjector inserito nella vena (indicato dalla freccia) e nanoparticelle iniettate nel flusso sanguigno (visto da compensazione di sangue). (C) Imaging unit contenente embrione aviaria con il coprioggetto interfacciato direttamente con il CAM. (D) Prima dell'iniezione nanoparticelle, vascolarizzazione tumorale viene valutata utilizzando l'imaging intravitale dopo l'iniezione di fluorescina destrano. (E) Imaging unit contenente l'embrione posizionato sul palcoscenico di un microscopio confocale in posizione verticale all'interno di una temperatura regolata impostata recinto a 37 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2808/2808fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Visualizzazione intravitale di assorbimento delle nanoparticelle nei tumori umani. I tumori sono visualizzate 7 ore dopo l'iniezione di (a) CPMV-AF647 e (b) CPMV-PEG-AF647. d) Escissione del tumore dall'embrione aviaria per successive analisi.

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<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CPMV+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">CPMV nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La membrana corioallantoidea (CAM) dell&#39;embrione aviaria è un modello utile per valutare la dinamica vascolare e la farmacocinetica di tumori umani. La struttura e la posizione del CAM consente l&#39;acquisizione di immagini di alta qualità e si adatta di molti generi di xenotrapianti tumorali senza procedure chirurgiche invasive. Inoltre, xenotrapianti tumorali del cancro impiantati nella membrana corioallantoidea diventare vascolarizzato entro 7 giorni, offrendo un rapido, poco costoso e mezzo semi-high-throughput per valutare l&#39;accumulo di nanoparticelle nei tessuti tumorali. Dal xenotrapianti cancro impiantati nel CAM di shell-meno embrioni di pollo sono accessibili al ottica ad alta risoluzione di un microscopio confocale o verticale epifluorescenza, informazioni contestuali e temporali per quanto riguarda l&#39;assorbimento delle nanoparticelle nel sistema vascolare del tumore può essere facilmente ottenuto. Xenotrapianti cancro in questo modello tendono a crescere lateralmente attraverso la CAM, provocando tumori che sono di grandi dimensioni pur rimanendo meno di 200 m di profondità. Questo li rende particolarmente adatto per l&#39;imaging intravitale perché standard di microscopi epifluorescenza può effettivamente penetrare l&#39;intera massa tumorale. Al contrario, i tumori impiantati in entrambi i siti superficiali o ortotopico all&#39;interno del mouse proliferano in tre dimensioni, rendendo difficile localizzare con precisione le nanoparticelle in profondità all&#39;interno di questi tumori con tecniche non invasive. Abbiamo utilizzato questo modello per valutare la diffusione di punti quantici, liposomi, nanoparticelle di ossido di ferro e in un certo numero di xenotrapianti tumorali umani, mettendo in evidenza il potenziale di questo modello per essere adatto per l&#39;analisi in vivo di una vasta gamma di formulazioni di nanoparticelle.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente Nome / attrezzature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Uova fecondate livorno </td><td> Frey `s Hatchery, St. Jacobs </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Dremel utensile rotante </td><td> Dremel </td><td></td><td> Può utilizzare qualsiasi modello </td></tr><tr><td> Ruote di taglio Dremel no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman incubatore </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td></td><td></td><td> 70% (vol / vol) </td></tr><tr><td> Polistirolo pesa barche </td><td> VWR </td><td> 12577-01 </td><td></td></tr><tr><td> Piazza Petri </td><td> Simport, VWR </td><td> 25378-115 </td><td></td></tr><tr><td> Rubbermaid contenitore in gomma con coperchio </td><td> Guillevin </td><td> RH3-228-00-BLU </td><td> fori in lati </td></tr><tr><td> Verticale pipetta estrattore </td><td> David Kopf Instruments </td><td> modello 720 </td><td> Impostazioni: 16,3 (riscaldamento) e 2.3 (solenoide) </td></tr><tr><td> Sodio tubi in vetro borosilicato capillari </td><td> Sutter strumento </td><td> BF100-58-10 </td><td> (OD, 1,0 mm, ID 0,58 millimetri, 10 cm lunghezza) </td></tr><tr><td> 1X Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> PBS (D-PBS) (1X), liquido </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) 4NA con EDTA, liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Invitrogen </td><td> 12483-020 </td><td> Calore inattivare </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser scientifico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga </td><td> Eppendorf modello 5810R </td><td> 5811 000.010 </td><td></td></tr><tr><td> Messa a punto di forcipe </td><td> VWR </td><td> 25607-856 </td><td></td></tr><tr><td> Tygon R-3603 tubi </td><td> VWR </td><td> 63009-983 </td><td> 50 ft (1/32-inch diametro interno, 3/32-inch diametro esterno, spessore parete 1/32-inch </td></tr><tr><td> Aghi ipodermici per preparazioni iniettabili 18-gauge aghi </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td> Scatola da 100 </td></tr><tr><td> Siringhe da 1 ml per preparazioni iniettabili </td><td> BD </td><td> 309602 </td><td> Scatola da 100 </td></tr><tr><td> Fibra ottica microscopio illuminatore </td><td> Amscope </td><td> HL 250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> Kimwipes </td><td> VWR </td><td> 10805-905 </td><td></td></tr><tr><td> Semi V. unguiculata (California occhio nero no. 5) </td><td> Burpee </td><td> 51771A </td><td></td></tr><tr><td> Luci di crescita interna </td><td> Sunlite, Alimentazione giardiniere </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Metil-PEO4 NHS-estere </td><td> Perforare </td><td> PI22341 </td><td></td></tr><tr><td> MPEG-NHS, PEG succinimidile estere, MW 2000 </td><td> NANOCS </td><td> PEG1-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor 647 acido carbossilico (succinimidile estere) </td><td> Invitrogen </td><td> A20006 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde 488 Estere di succinimidile * 6-isomero * </td><td> Invitrogen </td><td> O-6149 </td><td></td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Monoidrogeno fosfato dibasico </td><td> Sigma </td><td> 379980 </td><td> K2HPO4 (per il buffer phopshate) </td></tr><tr><td> Diidrogeno fosfato monobasico </td><td></td><td> P5655 </td><td> KH2PO4 (per il buffer phopshate) </td></tr><tr><td> Superose 6 Dimensioni esclusione colonna </td><td> GE Healthcare delle scienze della vita </td><td> 17-0673-01 </td><td></td></tr><tr><td> Akta Explorer 100 Cromatografo </td><td> GE Amersham Pharmacia </td><td> WS-AKTA100 </td><td></td></tr><tr><td> Akta kit di alta portata </td><td> GE Healthcare delle scienze della vita </td><td> 18-1154-85 </td><td></td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuga </td&gt; <td> Beckman </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ti rotore SW 28 </td><td> Beckman </td><td> 342204 </td><td> Altalena secchio </td></tr><tr><td> 50,2 Ti rotore </td><td> Beckman </td><td> 337901 </td><td> Angolo fisso </td></tr><tr><td> Amicon Ultra-15 Unità di centrifuga Filtro </td><td> Millipore </td><td> UFC910008 </td><td> 100 kDa tagliare </td></tr><tr><td> In disuso </td><td> Biorad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> destrano, fluoresceina, 70.000 MW, anionici </td><td> Invitrogen </td><td> D1823 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning microscopio a fluorescenza confocale disco </td><td> Quorum; Yokogawa CSU 10, Yokogawa </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Epifluorescenza a grande campo microscopio </td><td> Quorum; Zeiss Axio Examiner, Zeiss </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Hamamatsu Imagem 9100-12 EM-CCD </td><td> Quorum; Hamamatsu </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Unità di temperatura custodia per microscopio </td><td> Materie plastiche di precisione </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Vuoto grasso </td><td> VWR </td><td> 59344-055 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto di vetro circolare nr. 1 (18 mm) </td><td> VWR </td><td> 16004-300 </td><td></td></tr><tr><td> Volocity software </td><td> Perkin Elmer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Chick embrione recinto </td><td></td><td> abitudine fabbricata </td><td></td></tr><tr><td> Forbici delicato </td><td> VWR </td><td> 25608-203 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina </td><td> Bioshop </td><td> FOR201.500 </td><td> Uso in fumehood </td></tr><tr><td> Taglio ottimale </td><td> Fisher; Tissue Tek </td><td> 1437365 </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura (OCT) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Stampi di plastica </td><td> Pescatore </td><td> 22-038217 </td><td></td></tr><tr><td> VWR VistaVision HistoBond adesivo diapositive </td><td> VWR </td><td> 16004-406 </td><td></td></tr><tr><td> Prolungare oro con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lame monouso per criostato </td><td> Pescatore </td><td> 12-634-2 </td><td></td></tr><tr><td> Criostato </td><td> Leica CM 3050 S </td><td> 14047033518 </td><td></td></tr></table>

valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale imaging

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Le attuali tecnologie per l&#39;imaging del tumore, come l&#39;ecografia, risonanza magnetica, PET e CT, sono in grado di produrre immagini ad alta risoluzione per la valutazione di assorbimento delle nanoparticelle nei tumori a livello microscopico 1,2,3, mettendo in evidenza l&#39;utilità di un modello di xenotrapianto adeguata in cui per eseguire analisi dettagliate assorbimento. Qui, usiamo imaging ad alta risoluzione intravitale per valutare l&#39;assorbimento delle nanoparticelle in xenotrapianti di tumori umani in un modello di embrione modificato senza guscio di pollo. Il modello di embrione di pollo è particolarmente adatto per queste analisi in vivo in quanto supporta la crescita di tumori umani, è relativamente poco costoso e non richiede anestesia o la chirurgia 4,5. Le cellule tumorali forma pienamente xenotrapianti vascolarizzato entro 7 giorni una volta impiantati nella membrana corioallantoidea (CAM) 6. I tumori risultanti sono visualizzati da non invasive di imaging in tempo reale e ad alta risoluzione che può essere mantenuta per un massimo di 72 ore con un impatto minimo su entrambi l&#39;host o sistemi di tumore. Nanoparticelle con una vasta gamma di formati e formulazioni somministrato distale al tumore possono essere visualizzati e quantificabili, perché il flusso attraverso il flusso sanguigno, fuoriuscito da vasi sanguigni del tumore che perde, e si accumulano nella sede del tumore. Descriviamo qui l&#39;analisi delle nanoparticelle derivate da virus del mosaico del Cowpea (CPMV) decorati con coloranti fluorescenti nel vicino infrarosso e / o polimeri di polietilene glicole (PEG) 7, 8, 9,10,11. Dopo somministrazione per via endovenosa, queste nanoparticelle virali sono rapidamente internalizzati dalle cellule endoteliali, con conseguente etichettatura globale del sistema vascolare sia all&#39;esterno che all&#39;interno del tumore 7,12. PEGilazione delle nanoparticelle virale aumenta la loro emivita plasmatica, si estende il loro tempo in circolazione, e migliora in ultima analisi, il loro accumulo nei tumori attraverso la maggiore permeabilità e ritenzione (EPR) effetto 7, 10,11. La velocità e il grado di accumulo di nanoparticelle in un tumore è misurata nel tempo utilizzando un software di analisi delle immagini. Questa tecnica fornisce un metodo per visualizzare e quantificare sia le dinamiche di nanoparticelle nei tumori umani.

Vi presentiamo un nuovo approccio per quantificare la localizzazione delle nanoparticelle nei vasi di tumori umani xenotrapiantati utilizzando dinamica, imaging in tempo reale intravitale in un modello di embrione aviaria.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Le tecnologie attuali per l'imaging tumorale, quali l'ecografia, la risonanza magnetica (MRI), la tomografia a emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata (CT), non sono in grado di fornire immagini ad alta risoluzione per la valutazione di nanoparticelle...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare l'assorbimento di nanoparticelle nei tumori mediante imaging intra vitale. Ciò si ottiene innanzitutto rimuovendo il guscio ed eseguendo la coltura di embrioni aviani. Il secondo passaggio consiste nell'indurre tumori xenotrapiantati nella membrana corioallantoidea, o CAM, e lasciarli crescere per circa una settimana.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'iniettare per via endovenosa nanoparticelle nel cam e nell'eseguire un'immagine confocale intravitale in tempo reale del tumore xenotrapiantato. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'escissione e la sezione del tumore. Infine, l'assorbimento delle nanoparticelle da parte del tumore viene quantificato a partire dalle immagini e può essere effettuata un'analisi secondaria del tumore.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che consente di ottenere immagini ad alta risoluzione per valutare la dinamica dell'accumulo di nanoparticelle nei tumori a livello microscopico. Inoltre, utilizzando questo sistema modello, un singolo ricercatore può analizzare un numero molto elevato di gruppi sperimentali entro due settimane. In aggiunta, la membrana corioallantoidea degli embrioni di Shells è facilmente accessibile per manipolazioni fisiche e per imaging non invasivo.Il mio laboratorio si concentra sullo sviluppo di nanoparticelle per l'imaging molecolare mirato e il rilascio mirato di farmaci nel cancro. La nostra ricerca di un modello xenoinnestrato rapido ed economico in cui eseguire analisi dettagliate dell'assorbimento ci ha portati a utilizzare l'embrione di pollo con guscio. In questo studio, impieghiamo un imaging intravitale ad alta risoluzione per valutare l'assorbimento di nanoparticelle in xenoinnesti tumorali umani mediante un modello modificato di embrione di pollo con guscio.Per questo protocollo, preparare ed espiantare embrioni di pollo fecondati al quarto giorno. Utilizzando il metodo standard, verificare che gli embrioni siano fecondati e vitali controllando la presenza di un battito cardiaco e incubarli a 38 gradi Celsius con un'umidità relativa di almeno il 60% fino al nono giorno embrionale, quando gli embrioni saranno pronti per l'inoculazione delle cellule tumorali.Assemblare un microiniettore collegando un ago da 18 gauge a una siringa da un millilitro mediante un pezzo di tubo in teflon lungo da cinque a sei pollici. Inserire con attenzione il bisellato dell'ago nel tubo. Dalla punta dell'ago dovrebbe sporgere un tratto di tubo lungo circa quattro o cinque pollici.Ora, aspirare la sospensione di cellule tumorali attraverso il tubo nella siringa e capovolgerla. Toccare delicatamente il lato della siringa e premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria. Successivamente, inserire un ago di vetro per microiniezione all'estremità del tubo e premere lo stantuffo finché la sospensione cellulare non raggiunge la punta dell'ago.Ora, sotto un microscopio stereoscopico, iniettare lentamente e con attenzione da 10.000 a 100.000 cellule tumorali nello spazio interstiziale all'interno della cam. Le cellule dovrebbero formare un bolus visibile all'interno della cam; le cellule depositate sulla superficie della cam possono essere rimosse tamponando leggermente con un fazzoletto in tessuto non tessuto (kim wipe) o un bastoncino di cotone. A questo punto, reinserire gli embrioni in un incubatore a 38 gradi Celsius con un'umidità di almeno il 60%.Ha permesso al tumore di crescere e sviluppare vascolarizzazione fino a sette giorni, raggiungendo un diametro di almeno cinque millimetri prima dell'imaging. Le nanoparticelle devono essere marcate con un colorante fluorescente compatibile con il microscopio intravitale e conservate a quattro gradi Celsius in PBS, dove rimangono stabili per almeno un anno. Successivamente, centrifugare le nanoparticelle per un minuto per formare un pellet ed eliminare eventuali aggregati prima di caricarle nell'iniettore microscopico. Ora, utilizzando PBS per diluire le nanoparticelle, preparare una concentrazione lavorativa di un milligrammo per millilitro, al fine di iniettare 50 microgrammi di nanoparticelle in un volume di 50 microlitri.Ora procedere con le iniezioni al giorno 16 dello sviluppo embrionale. Verificare che i tumori siano sufficientemente vascolarizzati per selezionare i migliori embrioni portatori di tumore per via endovenosa. Iniettare una destrina fluorescente a basso peso molecolare, spettralmente distinta dalle cellule tumorali e dalle nanoparticelle.Quindi, visualizzare la destrina al microscopio a fluorescenza e selezionare gli embrioni con tumori più vascolarizzati. Una volta selezionati gli embrioni, utilizzare un microiniettore preparato per aggiungere almeno 200 microlitri dei nanoparticelle preparate. Capovolgere la siringa.Battere leggermente sul fianco e premere lo stantuffo per rimuovere eventuali bolle d'aria. Inserire ora un lungo ago microiniettore in vetro con punta affusolata all'estremità del tubo e premere lo stantuffo finché la soluzione di nanoparticelle non raggiunge la punta dell'ago. Un ago smussato non riesce a penetrare nell'ectoderma, mentre un ago eccessivamente appuntito e sottile si romperà durante l'inserimento nel tessuto.Successivamente, iniettare per via endovenosa da 30 a 200 microlitri di nanoparticelle negli embrioni, lontano dal lato desiderato da visualizzare immediatamente dopo l'iniezione delle nanoparticelle. I tumori, come descritto nella prossima sezione, iniziano preparando l'unità di imaging per l'embrione. Applicare innanzitutto uno strato sottile di grasso da vuoto lungo la circonferenza del portello di imaging sulla parte inferiore del coperchio.Quindi applicare un coperchio di vetro da 18 millimetri sul portello. Ora caricare l'embrione nell'unità in modo che il coperchio di vetro sia sopra l'area desiderata per l'acquisizione delle immagini. Abbassare lentamente il coperchio dell'unità finché il coperchio di vetro non entra appena a contatto con l'embrione e fissare il coperchio in posizione con le viti.Ora riempire la piastra contenente l'embrione con acqua a 37 gradi Celsius nell'unità di acquisizione immagini. Questa unità manterrà l'embrione in posizione sotto il microscopio confocale a disco rotante al microscopio a fluorescenza confocale a disco rotante. Verificare che la camera ambientale sia a 37 gradi Celsius.Ora, posizionare l'unità di acquisizione immagini sul palchetto in modo che la finestrella del vetrino sia direttamente sotto l'obiettivo del microscopio ed eseguire l'acquisizione delle immagini. Acquisire serie di immagini ad alta risoluzione del tumore e della vascolarizzazione circostante immediatamente dopo l'iniezione e a intervalli orari.In seguito, le immagini rifletteranno dettagliate modifiche strutturali che si verificano nella vascolarizzazione tumorale. L'embrione può essere osservato in modo continuo per un periodo fino a 36 ore senza necessità di cambiare il bagno d'acqua. Per quantificare l'assorbimento di nanoparticelle virali a partire dalle immagini, utilizzare un pacchetto software come velocity.Per prima cosa, selezionare il tumore e delimitarlo dallo stroma circostante. La selezione è facilitata etichettando il tumore con destrina fluorescente. Calcolare ora il segnale fluorescente medio proveniente dalle nanoparticelle nel tumore e in aree rappresentative dello stroma adiacente.Successivamente, calcola il rapporto del segnale medio. Rafforza la selezione del tumore rispetto al segnale medio. Rafforza la selezione dello stroma.Un rapporto maggiore di uno indica che le nanoparticelle sono localizzate preferenzialmente nel tumore. Le cellule di cancro del colon HT29 sono state iniettate per formare un bolus di circa un millimetro di diametro all'interno della membrana corioallantoidea al nono giorno. Gli embrioni di pollo, dopo sette giorni di incubazione, sono stati iniettati per via endovenosa con una destrina a basso peso molecolare per confermare la vascolarizzazione del tumore.L'amministrazione endovenosa di nanoparticelle di CPMV LOR 6 47 o di CPMV LOR 6 47 pegilato, seguita da un'immagine confocale in tempo reale ad alta risoluzione, ha rivelato che sia le nanoparticelle di CPMV che quelle di CPMV pegilato etichettano rapidamente l'intera vascolarizzazione. Entro 12 ore dall'iniezione, la quantificazione del segnale fluorescente nelle regioni tumorali rispetto a quelle del stroma ha mostrato che l'assorbimento del CPMV pegilato nel tumore era circa tre volte superiore rispetto a quello del CPMV. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'immagine intravitale ad alta risoluzione per valutare l'assorbimento di nanoparticelle in xenotrapianti tumorali in un modello di embrione aviario, dalla preparazione degli embrioni aviari al trapianto di cellule tumorali, dall'iniezione endovenosa di nanoparticelle alla valutazione dell'assorbimento delle nanoparticelle nei tumori mediante imaging confocale intravitale in tempo reale.

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