Name: Lanalisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-30T22:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Scopri come valutare quantitativamente la metastasi del cancro utilizzando il modello di membrana corioallantoide (CAM) nell'embrione di pollo. Questo metodo permette di analizzare la diffusione delle cellule tumorali umane con PCR specifica.

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Vogliamo riconoscere Tyson Foods Inc. per offrire generosamente le uova fecondate. Shanna Arnold è stato fondamentale durante le riprese di questo protocollo. Trenis Palmer è stato sostenuto dal National Institutes of Health sotto il Premio L. Ruth Kirschstein Servizio Nazionale delle Ricerche (F31 National Cancer Institute). Questo lavoro è stato parzialmente supportato da CCSRI di Grant # 700537 di JDL e NIH / NCI concedere # CA120711-01A1-01A1 e CA120711 ad AZ.

1. Preparare le uova di xenotrapianto (metastasi spontanea) <ol><li> Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 10 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora. </li><li> Il giorno 10 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d'oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d'uovo alla fine ottuso dell'uovo dove si trova il airsac. </li><li> La vena corioallantoidea si trova e segnato. Questa vena è situato nella parte superiore del guscio in cui è la giunzione di diverse grandi vasi sanguigni. A questo punto il ramo vaso sanguigno scende giù, lontano dalla CAM e attribuisce all'embrione. Una finestra di 1 centimetro quadrato è disegnato con la matita sul guscio circa 1 cm di distanza dal punto di diramazione della vena. L'area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Utilizzando uno strumento di taglio ruotante (Dremel) dotato di una pietra al carburo di silicio rettifica (parte Dremel # 84922), un buco si è esercitato attraverso l'estremità smussata dell'uovo nel sacco aria. Con questo strumento lo stesso un buco viene praticato all'interno della piazza precedentemente disegnato sopra l'uovo, fermandosi della membrana guscio d'uovo. Un 25-gauge siringa con una fresa multa alla fine è usato per fare un piccolo foro nella membrana guscio facendo attenzione a non strappare il sottostante CAM. Il CAM è successivamente staccato dalla membrana guscio d'uovo nella zona della piazza con aspirazione delicata creato con un aiuto pipetta automatica dotata di un pezzo di ¼ "tubo Tygon posto dopo il buco nel airsac. Al momento l'applicazione di aspirazione, una sacca d'aria devono sotto il buco nella piazza che significa che la CAM è stata con successo caduto dal guscio d'uovo. Dopo la CAM è caduto, il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in attesa del trapianto delle cellule tumorali. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale. </li></ol> 2. Preparare le uova per iniezione endovenosa (metastasi sperimentale) <ol><li> Appena deposto uova di gallina fecondate vengono incubate in un incubatore a rotazione per 12 giorni a 100 ° C e 60% di umidità. Le uova sono ruotate quattro volte ogni ora. </li><li> Il giorno 12 di sviluppo le uova sono posti dalla loro parte in un rack uovo. Una fonte a collo d'oca lampada o un altro leggero adatto è utilizzato per le uova candela facendo brillare la luce nel guscio d'uovo alla fine ottuso dell'uovo dove si trova il airsac. </li><li> La vena corioallantoidea si trova e segnato. Un rettangolo di 1 centimetro di 0,5 cm è disegnato con matita sul guscio direttamente sopra la vena. L'area compresa e intorno alla piazza è poi puliti con un batuffolo di cotone imbevuto di iodio. </li><li> Una piccola finestra viene creata nel guscio d'uovo nel percorso disegnato con la punta Dremmel (# 118). La finestra viene rimossa per esporre la membrana sottostante guscio d'uovo che viene successivamente reso trasparente con una goccia di olio minerale. Vedi 5A figura per una rappresentazione grafica. </li><li> A questo punto il buco nel sacco aereo e il foro situato nella piazza vicino alla vena corioallantoidea è sigillata con un pezzo di nastro nastro di laboratorio. Le uova vengono successivamente inserite in un incubatore fisso a 100 ° C e 60% di umidità in previsione di iniettare le cellule tumorali. </li></ol> 3. Preparazione cellule tumorali per l'innesto o iniezione. <ol><li> Per xenotrapianto, le cellule tumorali si staccano dalla loro piatti dalla cultura utilizzando tripsina / EDTA e lavate con 10 volumi di tampone fosfato (PBS) al fine di rimuovere tutti i supporti residuo, tripsina, o EDTA. </li><li> Per iniezione endovenosa, cellule in coltura sono staccati utilizzando cellule dissociazione non enzimatica soluzione, e lavato con DMEM senza siero. e) </li><li> Le cellule sono contati con un emocitometro e risospese in PBS a 1-40 cellule / ml per l'innesto, o in alternativa risospese in DMEM senza siero a 1 milione di cellule / ml per iniezione ev. </li></ol> 4. L'innesto delle cellule tumorali sul esposte di recente CAM (metastasi spontanee) <ol><li> Le uova vengono rimossi dal termostato e una piccola finestra è tagliata nella posizione della piazza precedentemente disegnato dove la bolla d'aria nuova si è formata. Ciò è più facilmente realizzabile con un utensile rotante dotato di una rotella di taglio (utensili Dremel con il # 409 ruota di taglio circolare). Un paio di pinze ad ago naso viene utilizzato per rimuovere la piccola sezione di guscio d'uovo e di esporre il CAM sottostante. </li><li> Utilizzando un cotone con punta applicatore (Brand Fisher # 23-400-001) la CAM è abrasa 5 volte. Un po 'di sangue dovrebbe essere evidente sul cotone. Immediatamente dopo danneggiare il CAM, 25μl di sospensione cellulare viene posizionato sulla zona danneggiata. Il numero ottimale di cellule è determinato empirically ma può variare da 5 a 0.5x10 1X10 6. La finestra nel uovo è ben sigillati con nastro adesivo ed i pulcini sono rimasti in piedi per 10-15 minuti in modo da consentire alle cellule di regolare. Dopo 15 minuti le uova vengono restituiti al fermo incubatrice. </li><li> I tumori sono permesso di crescere per 5-8 giorni a seconda della specifica applicazione e la natura della linea di cellule tumorali utilizzati. Si veda la figura 1 per una rappresentazione sequenziale. </li></ol> 5. Iniezione endovenosa di cellule tumorali (metastasi Sperimentale) <ol><li> Utilizzando un contatore 30 100μl siringa di insulina di sospensione cellulare viene iniettata nella vena allantoide di ogni embrione, le uova sono stati restituiti ad un incubatore stazionaria e vi rimase per altri 1-7 giorni. </li><li> In momenti distinti, il polmone o inferiore CAM vengono raccolte da ogni embrione e trattati per l'individuazione delle cellule tumorali, come descritto di seguito. </li></ol> 6. Tumori raccolta e tessuti pulcino <ol><li> Una zona dissezione è preparato. Il test rileva cellule metastatiche da quantificare il DNA umano con un approccio altamente sensibile della PCR. E 'quindi molto importante per evitare la contaminazione con il DNA esogeno. Dissezioni vengono eseguiti in un'area dedicata e in tutto il dissezioni gli strumenti sono puliti tra ogni animale. Al fine di prevenire la contaminazione incrociata dei campioni di tutto il processo di dissezione 3 insiemi separati di strumenti sono utilizzati: un set per tagliare l'uovo, uno per la rimozione del tumore primario e uno per la rimozione degli organi interni. Inoltre, quattro contenitori sono usati per lavare sequenziale risciacquo di strumenti tra ogni animale. In sequenza queste soluzioni di lavaggio sono: 1) Acqua bidistillata, 2) acqua bidistillata, 3) candeggina e 4) 70% di etanolo. </li><li> Le uova vengono rimossi dal fermo incubatore e messo in ghiaccio per 15 minuti per anestetizzare gli animali e eutanasia. Le finestre sono aperte in modo che i tumori diventano visibili. Aprire le finestre più grandi, rimuovendo alcune delle guscio può essere necessario. I tumori primari sono resecati dal CAM, pesato, e trattati per istologia. </li><li> Il pulcino è rimosso dal guscio d'uovo tagliando il guscio radialmente in due metà uguali. L'embrione viene decantato dalla shell taglio e trasferito in una parte pulita del seno barca soppesare. L'animale è sezionato con l'utilizzo di un nuovo, pulito serie di strumenti. L'animale è aperta con il taglio dello sterno. Una volta che l'embrione è aperta, un pezzo del fegato sia dal lobo destro o sinistro viene raccolto. Gli organi interni sono successivamente rimosso tirando delicatamente l'esofago collegato al ventriglio e il taglio del visera che collegano gli organi. Al fine di raccogliere i polmoni tagliare la cassa toracica è aperta la piastra del seno è separata e il cuore è stato rimosso. A questo punto è possibile tagliare intorno ai quattro lati del polmone (la parte superiore più vicina alla testa sul lato sinistro lungo la gabbia toracica, la parte inferiore vicino al diaframma e il lato destro lungo la trachea). Per motivi di coerenza, il polmone stesso è raccolto in ogni animale. Campioni di tessuto raccolte sono conservati a -20 ° C per un uso successivo o possono essere trattati immediatamente per l'isolamento di DNA. </li></ol> 7. Isolamento del DNA genomico e analisi PCR quantitativa <ol><li> Il DNA genomico viene estratto dai tessuti utilizzando il SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit (Sigma-Aldrich Catalogo # XNATRG). Il DNA estratto può essere trasferito in una provetta pulita eppendorf e conservati a -20 ° C o utilizzato immediatamente. E 'importante per diluire il DNA 1:50 in acqua priva di nucleasi prima di utilizzarlo nella successiva reazione di PCR. In alternativa, il DNA può essere estratto con un qualsiasi numero di protocolli standard di estrazione del DNA (Zijlstra et al., 2002). </li><li> Il DNA umano è rilevato nei tessuti pulcino con PCR quantitativa specifica per l'uomo sequenze Alu. PCR quantitativa utilizzando Alu-primer specifico viene eseguita utilizzando l'amplificazione SYBR green dal exract-N-Amp kit. Il kit PCR viene fornito con una miscela di reazione contenente 2x SYBR green, tampone, sali dNTP, Taq polimerasi e l'anticorpo Jumpstart Taq. La miscela di reazione è costituita in un volume finale di 15μl, con 0.4μM di ciascun primer. Per la maggior parte dei casi utilizzando il DNA estratto diluito 1:50 fornirà dati quantitativi, tuttavia, la quantità ottimale di DNA stampo può essere necessario ottimizzare empiricamente. Pollo primer GAPDH sono utilizzati come controllo interno è gestito La PCR nelle seguenti condizioni per le sequenze Alu: attivazione della polimerasi a 95 ° C per 2 minuti seguiti da 30 cicli a 95 ° C per 30 secondi, 63 ° C per 30 s. , 72 ° C per 30 s. Le condizioni di reazione per il pollo GAPDH sono identiche a quelle descritte per Alu tuttavia, può essere necessario estendere la PCR a 40 cicli. </li><li> L'analisi quantitativa di metastasi viene eseguita utilizzando il metodo del confronto ΔΔCt gruppi sperimentali ad un gruppo di controllo (Schmittgen e Livak, 2008;. Zijlstra et al, 2002). In alternativa una curva standard può essere generato usando una serie di diluizioni di cellule tumorali umane estratte utilizzando il Extract-N-Amp Kit (Zijlstra et al., 2002). La significatività statistica viene valutata utilizzando Student t-test o analisi Anova di controllo e di gruppi sperimentali. </li></ol> 8. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Il modello di embrione di pollo metastasi. A) Un pannello di quattro diagramma illustra l'aspetto del modello in sezione trasversale a fasi principali: 1. Dopo 10 giorni di incubazione. Il CAM ha raggiunto quasi le dimensioni massime. Le arterie e le vene sono nettamente visibili con la vena allantoide posizionato contro la parte superiore dell'uovo. 2. L'uovo subito dopo la foratura due fori nel guscio d'uovo: uno nell'altro airsac e adiacente al punto di attacco per la vena allantoideo uno. 3. L'aspetto dopo un vuoto dolce è stato utilizzato per evacuare l'airsac e rilasciare il CAM. Cellule tumorali (blu) vengono applicate alla CAM caduto. 4. Dopo aver consentito al innestato cellule tumorali a crescere, il tumore con tessuti dai embrione di pollo vengono raccolti per l'analisi B) Una rappresentazione di serie del modello: 1.. L'incubazione delle uova., 2. Segnando la posizione della vena allantoide., 3. I fori nel guscio d'uovo., 4. Cadere la CAM., 5. Taglio di apertura per l'innesto delle cellule tumorali., 6. Applicando le cellule tumorali., 7. Raffreddamento le uova sul ghiaccio prima della raccolta del tessuto., 8. La raccolta del tumore dopo 7 giorni di crescita. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Istologia dei tumori CAM. I tessuti prelevati da membrana cuscinetto tumore corioallantoidea è stato fissato in formalina, sezionati e trattati con una macchia tricromica. A) HEP3 tumore dopo sette giorni di crescita sul CAM. B e C mostrano regioni magnificato dalla A mostrare sia del tumore e stroma. D) normali CAM. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Analisi quantitativa longitudinale di metastasi. Varianti per la testa e il collo con carcinoma HEP3 alta o bassa capacità metastatica (HEP3 M (High) e HEP3 M (basso), rispettivamente) sono stati analizzati per la loro capacità di diffondere tramite Alu PCR. Dieci animali sono stati analizzati in ogni punto volta per la durata di 7 giorni. Questi campioni sono stati quantificati contro una curva standard e successivamente espressa # cells/50mg tessuti. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. L'inibizione delle cellule metastasi spontanee negli animali trattati con l'anticorpo 1A5 inibire le metastasi. I tumori si sono formati utilizzando 5X10 5 HEP3 cellule applicato al CAM del giorno-10 embrioni. Tre giorni dopo l'applicazione delle cellule tumorali sono state trattate metà degli animali con l'anticorpo anti-CD151 1A5. I polmoni di animali portatori di tumore sono state raccolte due giorni dopo e sottoposto a restrizioni quantitative real-time PCR alluminio. Al contrario quantitativa real-time PCR di chGAPDH è stata utilizzata per confermare la presenza di quantità equivalenti di DNA genomico ospite (ΔΔCt Il metodo è stato utilizzato per confrontare i due gruppi quantitativamente (B). <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Valutare l'arresto, la crescita, e intravasation nella cascata metastatica. Fondamentalmente, le metastasi di un organo secondario è definito dal contributo di tre aspetti: l'arresto, il tasso di crescita, e il tasso di intravasation. Questi possono essere quantificati utilizzando una combinazione di metastasi sperimentali (A) e metastasi spontanee (B). Utilizzando metastasi sperimentali (A) è definito come l'arresto del numero di cellule rilevate 2 ore dopo l'iniezione. Sopravvivenza e la crescita delle cellule arrestato è determinato come la variazione di iniezione numero di cellule 24 ore dopo. La crescita è definito come il tasso di proliferazione nei giorni 3-7. Intravasation è determinato utilizzando metastasi spontanee (B), dove il numero di cellule intravasated è definito come l'attuale carico metastatico il giorno 7 che supera il valore previsto dalla crescita degli oneri metastatico presenti il ​​giorno 6. <img src="/files/ftp_upload/2815/2815fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Espansione visualizzazione delle metastasi nel CAM. HEP3 cellule che esprimono GFP sono state iniettate per via endovenosa in 12 giorni di sviluppo. Il giorno 1, 3 e 5 è stato sacrificato un uovo e una sezione di CAM è stato ripreso con uno stereo microscopio a fluorescenza. Lo sfondo verde scuro viene creata dal guscio d'uovo, il sistema vascolare è visibile come linee nere, e le cellule tumorali sono visibili come macchie verdi brillanti.

<ol><li>Ghiso, A. guirre, Kovalski, J. A., K,, Ossowski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+induced+by+downregulation+of+urokinase+receptor+in+human+carcinoma+involves+integrin+and+MAPK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy induced by downregulation of urokinase receptor in human carcinoma involves integrin and MAPK signaling.</a> J Cell Biol. 147, 89-104 (1999).</li>
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<li>Chambers, A. F., Wilson, S. M., Tuck, A. B., Denhardt, G. H., Cairncross, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metastatic+properties+of+a+variety+of+mouse%2C+rat%2C+and+human+cells+in+assays+in+nude+mice+and+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Comparison of metastatic properties of a variety of mouse, rat, and human cells in assays in nude mice and chick embryos.</a> In Vivo. 4, 215-219 (1990).</li>
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<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat Med. 12, 354-360 (2006).</li>
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<li>Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibition+of+Tumor+Cell+Intravasation+and+Subsequent+Metastasis+via+Regulation+of+In+Vivo+Tumor+Cell+Motility+by+the+Tetraspanin+CD151%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The Inhibition of Tumor Cell Intravasation and Subsequent Metastasis via Regulation of In Vivo Tumor Cell Motility by the Tetraspanin CD151.</a> Cancer Cell. 13, 221-234 (2008).</li>
<li>Zijlstra, A., Mellor, R., Panzarella, G., Aimes, R. T., Hooper, J. D., Marchenko, N. D., Quigley, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+rate-limiting+steps+in+the+metastatic+cascade+using+human-specific+real-time+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of rate-limiting steps in the metastatic cascade using human-specific real-time polymerase chain reaction.</a> Cancer Res. 62, 7083-7092 (2002).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il CAM pulcino è stato utilizzato per decenni come sistema modello per studiare vari aspetti della biologia del cancro e nella progressione metastatica. Valutazione principio della capacità metastatica sono stati effettuati in questo modello da una varietà di gruppi, tra cui l&#39;analisi di dormienza (Aguirre Ghiso et al, 1999;. Ossowski e Reich, 1983), rimodellamento dei tessuti (Deryugina et al, 2005;. Hahn-Dantona . et al, 1999), e le metastasi (Zijlstra et al, 2008;. Zijlstra <em...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 1X Dulbecco modificato (DMEM) </td><td> Invitrogen </td><td> 11995073 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) (1X), liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 14190250 </td><td> pH 7,4 </td></tr><tr><td> Tripsina, 0,05% (1X) 4NA con EDTA, liquido </td><td> Invitrogen </td><td> 25300054 </td><td></td></tr><tr><td> Sportsman hatcher </td><td> Berry Hill </td><td> 1550HA </td><td rowspan="2"> Questi incubatori sono alcuni tra i più facilmente reperibili. Tuttavia, il video mostrerà diverse apparecchiature. </td></tr><tr><td> Sportsman incubatore </td><td> Berry Hill </td><td> 1502EA </td><td></td></tr><tr><td> Dremel utensile rotante </td><td> Dremel </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ruote di taglio Dremel no. 36 </td><td> Dremel </td><td> 409 </td><td></td></tr><tr><td> Portatile Pipettare aiuti </td><td> Pescatore </td><td> 1368115E </td><td></td></tr><tr><td> Cotone Tipped Applicatori </td><td> Pescatore </td><td> 23-400-001) </td><td></td></tr><tr><td> Le uova fecondate </td><td> Vari </td><td></td><td> Molti vendor differenti possono essere utilizzati. Le uova devono essere di circa 35-55 grammi. Le galline che li pone dovrebbe essere compresa tra 36 e 55 settimane di età. </td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser scientifico, VWR </td><td> 15170-090 </td><td></td></tr><tr><td> Fibra ottica microscopio illuminatore </td><td> Amscope </td><td> HL 250-AY </td><td> 150W </td></tr><tr><td> 25 gauge </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green Extract-N-Amp PCR Tissue Kit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> XNATRG </td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria embryo

Quantitative Analysis of Cancer Metastasis using an Avian Embryo Model

Durante le cellule tumorali metastasi disseminare dal tumore primario, invadere i tessuti circostanti, e si diffuse in organi distanti. Metastasi è un processo complesso che può coinvolgere diversi tipi di tessuto, periodi lasso di tempo variabile, e spesso si verificano in profondità all&#39;interno degli organi, rendendo difficile indagare e quantificare. Inoltre, l&#39;efficacia del processo metastatico è influenzato da più passaggi nella cascata metastatica rendendo difficile valutare il contributo di un singolo aspetto del comportamento delle cellule tumorali. Di conseguenza, le analisi sono eseguite frequentemente metastasi negli animali da esperimento per fornire un contesto necessariamente realistica in cui studiare metastasi. Sfortunatamente, questi modelli sono ulteriormente complicata dalla loro fisiologia complessi. L&#39;embrione di pollo è un unico modello in vivo che supera molti limiti allo studio di metastasi, a causa della accessibilità della membrana corioallantoidea (CAM), una buona vascolarizzazione dei tessuti extra-embrionali trova sotto il guscio d&#39;uovo che è ricettivo ai xenotrapianto di cellule tumorali (figura 1). Inoltre, poiché l&#39;embrione di pollo è naturalmente immunodeficienti, il CAM supporta facilmente l&#39;attecchimento dei tessuti normali e tumorali. Soprattutto, il CAM aviaria supporta con successo le caratteristiche delle cellule tumorali tra cui la maggior parte della crescita, invasione, angiogenesi, e il rimodellamento del microambiente. Questo rende il modello particolarmente utile per lo studio delle vie che portano alla metastasi del cancro e di prevedere la risposta del tumore metastatico a nuovi potenziali terapie. La rilevazione di cellule diffusi da specie-specifico Alu PCR permette di valutare quantitativamente metastasi in organi che sono colonizzati da un minimo di 25 celle. Utilizzando la linea di carcinoma epidermoide umano (HEP3) usiamo questo modello per analizzare metastasi spontanea delle cellule tumorali in organi distanti, tra cui il pulcino fegato e polmoni. Inoltre, utilizzando la Alu-PCR protocollo dimostriamo la sensibilità e la riproducibilità del test come strumento per analizzare e quantificare intravasation, arresto, stravaso, e la colonizzazione come singoli elementi di metastasi.

Utilizzando la PCR quantitativa, ci dimostrano come la consolidata pulcino modello CAM può essere utilizzato per analizzare quantitativamente la metastasi di cellule tumorali in organi distanti.

L&#39;analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

Durante la metastasi, le cellule tumorali si diffondono dal tumore primario, invadono i tessuti circostanti e si propagano verso organi distanti. La metastasi è un processo complesso...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare quantitativamente l'abilità metastatica delle cellule tumorali utilizzando la membrana corioallantoidea o CAM come modello di xenotrapianto. Questo viene ottenuto innanzitutto incubando uova fecondate fino a quando non sviluppano una CAM matura. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'iniettare per via endovenosa o nel trapiantare in modo topico cellule tumorali sulla CAM.Dopo un intervallo di tempo definito sperimentalmente, il tessuto viene raccolto per l'analisi, quindi le metastasi vengono quantificate mediante PCR specifica per l'uomo, rivolta alla sequenza dell'allele umano, e i risultati vengono analizzati. Mi chiamo Trent Palmer. Sono uno studente laureato nel laboratorio del Dott. Andre Zilstra.Dimostrerò il modello di xeno innesto e quello di metastasi spontanea, mentre il mio mentore, la dottoressa Zilstra, mostrerà l'iniezione endovenosa e il modello di metastasi sperimentale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai modelli esistenti è la rapidità e la facilità con cui uno sperimentatore può effettuare uno studio quantitativo. La metastasi delle cellule tumorali umane può essere studiata sperimentalmente impostando circa 120 animali e completando l'intero protocollo da inizio a fine nell'arco di due settimane.Considerata la facile accessibilità dell'embrione di pollo e la semplicità delle manipolazioni, il sistema può essere agevolmente esteso ad altre applicazioni X ovo. Questo è ciò che abbiamo realizzato negli ultimi anni ed è oggetto di ulteriori verticali JoVE. Uova di pollo fecondate appena deposte vengono incubate in un incubatore rotante quattro volte all'ora per 10 giorni.Al decimo giorno, posizionare le uova di lato su un portauova e illuminare con una sorgente luminosa intensa e diretta il guscio all'estremità più larga dell'uovo, dove si trova la camera d'aria. Individuare quindi il punto di biforcazione della vena corioallantoidea. Questo punto viene identificato più facilmente ruotando l'uovo entro un angolo di 20 gradi rispetto al suo asse longitudinale.Per visualizzare il punto in cui il vaso si stacca dal guscio, a un centimetro dal punto di biforcazione della vena coroidea, disegnare un quadrato di un centimetro di lato. Quindi pulire l'area intorno al quadrato con un batuffolo imbevuto di iodio. Utilizzando un Dremel dotato di una punta in carburo di silicio, praticare prima un foro attraverso l'estremità ottusa dell'uovo fino alla camera d'aria, quindi un secondo foro all'interno del quadrato, fermandosi poco prima della membrana del guscio. Ora utilizzare con attenzione un ago da 25 gauge con una sottile lima all'estremità per sollevare delicatamente la membrana del guscio d'uovo, eseguendo correttamente l'operazione. In questo modo non si strapperà la cam sottostante né si staccherà la cam dalla membrana sottostante. Usare una pipetta automatica dotata di un pezzo di tubo in teflon da un quarto di pollice.Applicare un'aspirazione delicata sul foro della sacca d'aria e verificare la presenza di una bolla d'aria al di sotto del foro nel quadrato, segno di successo. Se la camma si danneggia durante l'alterazione della membrana del guscio dell'uovo, la lattina non scenderà in modo evidente. Quando la sacca d'aria viene aspirata durante la rotazione dell'uovo, l'aria visibile appena sotto il guscio viene aspirata all'interno e sotto la camma danneggiata.Queste uova non possono essere utilizzate dopo che la cam è stata abbassata. Chiudere entrambi i fori con un pezzo di nastro da laboratorio e riposizionare le uova in un incubatrice stazionaria. Le uova sono ora pronte per il xenotrapianto.Iniziare preparando le cellule tumorali per il trapianto eterologo. Innanzitutto, staccare le cellule dalle loro piastre di coltura utilizzando tripsina EDTA. Completare la preparazione delle cellule misurandone la densità con un emocitometro e ri-sospendendole in PBS a una concentrazione di 10-40 milioni di cellule per millilitro.Ora, dopo aver sterilizzato l'incubatore e lo strumento Dremel con etanolo, rimuovere le uova dall'incubatrice. Aprire una finestra nella parte superiore del guscio dell'uovo e, utilizzando un applicatore con estremità di cotone, passare delicatamente il cotone cinque volte sull'area danneggiata; dovrebbe comparire un po' di sangue sul cotone. Iniettare immediatamente 25 microlitri della sospensione cellulare, pari a mezzo milione e fino a un milione di cellule.Ora sigillare la finestra con nastro da laboratorio e lasciare sedimentare le cellule per 10-15 minuti. Dopo 15 minuti, riposizionare le uova nell'incubatrice stazionaria, dove i tumori potranno crescere per cinque-otto giorni. Utilizzando la stessa incubazione illustrata nella sezione due, raccogliere uova di 12 giorni.Posizionare un uovo davanti alla sorgente luminosa per individuare e marcare la vena corioallantoidea direttamente al di sopra della vena. Tracciare un rettangolo di un centimetro per 0,5 centimetri e pulire l'area con un batuffolo imbevuto di iodio. Utilizzando ora un trapano dotato di punta, praticare una piccola finestra nel guscio dell'uovo lungo il rettangolo.Rimuovere con attenzione la finestra del guscio dell'uovo per esporre la membrana sottostante. Aggiungere una goccia di olio minerale sulla membrana esposta, rendendola trasparente. Prelevare le uova dall'incubatrice e utilizzare una siringa per insulina da 30 gauge.Iniettare 100 microlitri di sospensione cellulare nella vena auic di ciascun embrione. Successivamente, applicare un pezzo di nastro adesivo da laboratorio sulle membrane esposte e riposizionare le uova in un incubatore stazionario per i successivi uno a sette giorni. Il polmone o la cam inferiore vengono prelevati per la rilevazione delle cellule tumorali come illustrato nella sezione seguente.È fondamentale eseguire questo passaggio della procedura in un'area dedicata alle dissezioni e con un'assoluta minima possibilità di contatto con il DNA. Per prevenire la contaminazione incrociata dei campioni, utilizzare tre set separati di strumenti per tagliare l'uovo, rimuovere il tumore primario e rimuovere gli organi interni, sia prima di iniziare che tra una dissezione e l'altra. Lavare ogni set di strumenti una volta con candeggina, una volta con etanolo al 70% e due volte con acqua doppio-distillata.Le uova vengono rimosse dall'incubatrice stazionaria e collocate su ghiaccio per 15 minuti. Per anestetizzare ed eutanasizzare gli animali, si aprono le finestre in modo che i tumori diventino visibili. Potrebbe essere necessario allargare le finestre per esporre completamente i tumori.Ora rimuovere i tumori primari dalla cam. Utilizzando un set pulito di strumenti, pesare i tumori ed elaborarli per l'istologia. Successivamente, procedere con il prelievo degli organi.Iniziare rimuovendo il pulcino dal guscio. Per fare ciò, tagliare il guscio radialmente in due metà uguali. Quindi versare l'embrione di pulcino dal taglio.Estrararre inoltre due frammenti di cam da ciascun lato del guscio dell'uovo utilizzando uno strumento perforante e posizionarli in un tubo eppendorf. Trasferire il pulcino su un portauovo con il petto rivolto verso l'alto. Utilizzando un set pulito di strumenti da dissezione, aprire l'embrione praticando un'incisione attraverso l'addome e lo sterno ed esponendo la cavità addominale.Per prima cosa, prelevare un frammento di fegato dal lobo destro o sinistro. Ora gli organi possono essere estratti con attenzione recidendo le strutture viscerali che li collegano. Selezionare un polmone e tagliare lungo i suoi quattro lati per liberarlo dalla gabbia toracica.Per garantire coerenza, raccogliere lo stesso polmone da ciascun animale. Se alcuni organi non vengono processati immediatamente, conservarli a meno 20 gradi Celsius.Dopo la rimozione di un istotipo tumorale epatico xenotrapiantato è stata eseguita un'analisi istologica. Questa è una colorazione tri RME del tumore Hep three. Il componente stromale del tumore è chiaramente evidente tra i lobi distinti del tumore.Qui, cellule epatiche hep tre che esprimono GFP sono visualizzate mediante microscopia fluorescente dopo iniezione endovenosa. Un giorno dopo l'iniezione endovenosa sono visibili solo singole cellule tumorali isolate; tre giorni dopo l'iniezione, è evidente un aumento del numero di cellule e la formazione di piccole colonie di cellule metastatiche. Il livello di metastasi nel corso di sette giorni successivi al trapianto è stato quantificato mediante PCR in tempo reale per la sequenza umana A LU.La tecnica che abbiamo dimostrato oggi è un modello quantitativo ad alto valore. Una volta padroneggiata, uno sperimentatore può preparare circa 30 animali all'ora e, inoltre, nell'arco di due settimane, le metastasi possono essere analizzate quantitativamente utilizzando il modello dell'embrione aviario dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della biologia del cancro di analizzare quantitativamente le metastasi impiegando un modello naturalmente immunodeficiente.

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Questo video descrive un metodo di microiniezione per la consegna di cellule di cancro al seno nello spazio perivitellino di embrioni di pesce zebra transgenico. Dopo l'incubazione, visualizziamo l'embrione al microscopio a fluorescenza per osservare l'invasione, la disseminazione e la metastasi delle cellule tumorali.

zPDX-Analisi dell'invasività: studio del comportamento invasivo delle cellule tumorali metastatiche negli xenotrapianti di embrioni di zebrafish

In questo video, descriviamo l'impianto di cellule tumorali su una membrana corioallantoidea di pollo per generare un modello in ovo. Il modello innesta con successo le cellule tumorali ovariche per studiare la progressione del cancro ginecologico.

Modellazione del cancro basata sulla membrana corioallantoica del pollo: un modello in ovo per studiare la tumorigenesi e le metastasi delle cellule tumorali

Questo video dimostra la procedura di iniezione endovenosa di cellule tumorali nel sistema vascolare della membrana corioallantoica di pollo per generare un modello di metastasi tumorali CAM. Le cellule iniettate alla fine formano colonie sparse di singole cellule tumorali, consentendo lo studio dell'invasione e delle metastasi del cancro.

Iniezione endovenosa di cellule tumorali nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo: una procedura per stabilire un modello di cancro della membrana corioallantoica per studiare l'invasione e le metastasi del cancro

Qui, il monitoraggio in tempo reale del metabolismo delle cellule tumorali, combinato con un modello di metastasi in vivo di membrana corio-allantoica (CAM) di embrione di pollo, viene utilizzato per valutare nuovi bersagli/agenti antitumorali per la loro capacità di sensibilizzare le cellule tumorali ai chemioterapici dannosi per il DNA.

Valutare l&#39;efficacia delle Cancer Drug Sensibilizzazione<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Qui, descriviamo modelli zebrafish xenotrapianto utilizzando due differenti siti di iniezione, vale a dire, lo spazio perivitellino e condotto di Cuvier, per studiare il comportamento invasivo e per valutare l'intravasation e stravaso potenziale delle cellule umane di cancro al seno, rispettivamente.

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

Il carcinoma a cellule renali a cellule chiare metastatiche è una malattia senza un modello animale completo per un'indagine preclinica approfondita. Questo protocollo illustra due nuovi modelli animali per la malattia: il modello di topo ortotopicamente impiantato e il modello a membrana corioallantoica del pollo, che dimostrano entrambe metastasi polmonari simili a casi clinici.

Confrontando il modello di carcinoma a cellule renali a celle chiare metastatico stabilito nel rene del topo e sulla membrana coroallantoica del pollo

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

L'approccio descritto combina saggi sperimentali di metastasi della vena della coda con immagini animali vive in vivo per consentire il monitoraggio in tempo reale della formazione e della crescita della metastasi del cancro al seno, oltre alla quantificazione del numero e delle dimensioni delle metastasi nei polmoni.

Uso combinato dei saggi di metastasi della vena della coda e dell'imaging in vivo in tempo reale per quantificare la colonizzazione metastatica del cancro al seno e il carico nei polmoni

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Il test CAM-Delam per valutare la capacità metastatica delle cellule tumorali è relativamente veloce, facile ed economico. Il metodo può essere utilizzato per svelare i meccanismi molecolari che regolano la formazione di metastasi e per lo screening farmacologico. Un test ottimizzato per l'analisi di campioni di tumore umano potrebbe essere un metodo clinico per il trattamento personalizzato del cancro.

Test CAM-Delam per valutare le proprietà metastatiche quantificando la capacità di delaminazione e invasione delle cellule tumorali

Scopri come valutare quantitativamente la metastasi del cancro utilizzando il modello di membrana corioallantoide (CAM) nell'embrione di pollo. Questo metodo permette di analizzare la diffusione delle cellule tumorali umane con PCR specifica.

L'analisi quantitativa delle metastasi del cancro utilizzando un modello di aviaria Embryo

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