Valutazione dello Sviluppo ghiandola mammaria e funzione in modelli murini

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare lo sviluppo della ghiandola mammaria in topi di tipo selvatico e mutanti. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando un topo per esporre le ghiandole mammarie. Successivamente, le ghiandole mammarie vengono correttamente prelevate e stese su vetrini, calm lum.

Quindi, si utilizza una colorazione per analizzare il grado di sviluppo dell'epitelio. Infine, si analizzano le contrazioni dei miociti epiteliali in seguito all'esposizione all'ossitocina, INEA J.Ultimamente, i risultati ottenuti riveleranno se i dotti della ghiandola mammaria e gli alveoli si sono formati correttamente e se il miocita epiteliale può essere indotto a contrarsi ed espellere il latte in seguito all'esposizione all'ossitocina. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali relative allo sviluppo e alla differenziazione della ghiandola mammaria, come l'impatto di una mutazione genica o di un knockout genico sulla morfologia e sulla funzione della ghiandola mammaria.

La dimostrazione visiva di questo metodo garantisce un'adeguata dissezione della ghiandola mammaria, poiché sia il montaggio su foro sia il saggio basato sull'ossitocina richiedono ghiandole mammarie ben preparate. Una dissezione inadeguata della ghiandola può portare all'assenza di alcuni dotti epiteliali o alla presenza di tessuti estranei come pelle o tessuto muscolare. Almeno un giorno prima della dissezione, preparare la soluzione di allume di CalMin sciogliendo un grammo di CalMin e 2,5 grammi di solfato di alluminio e potassio in 500 millilitri di acqua distillata.

Fare bollire la soluzione per 20 minuti in un pallone da un litro, portare il volume finale a 500 millilitri con acqua. Filtrare la soluzione attraverso una carta Watman e aggiungere alcuni cristalli di tiolo come conservante. Successivamente, refrigerare la soluzione dopo la colorazione.

La soluzione di allume di carbonio può essere versata nuovamente nel flacone di riserva e riutilizzata molte volte per diverse settimane. Preparare una soluzione fresca quando il colore diventa tenue. Per iniziare la dissezione della ghiandola della memoria, sacrificare un topo mediante inalazione di anidride carbonica.

Evitare, se possibile, la dislocazione cervicale poiché potrebbe danneggiare i vasi sanguigni principali del collo e causare l'accumulo di sangue intorno alla ghiandola mammaria numero uno, rendendone più difficile la dissezione su schiuma di polistirolo avvolta nella pellicola. Posizionare il topo supino e distendere le quattro zampe.

Fissare saldamente tutti e quattro gli arti utilizzando aghi da 16 a 20 gauge. Spruzzare abbondantemente il topo con etanolo al 70% utilizzando pinze. Sollevare la pelle addominale lungo la linea mediana ed effettuare una piccola incisione con forbici affilate a partire dall'incisione.

Tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando di perforare le cavità addominale o toracica. Tagliare la pelle sulle zampe anteriori fino all'incisione mediana, ottenendo una forma a Y. Tagliare la pelle sulle zampe posteriori nello stesso modo.

Utilizzando pinze emostatiche, staccare delicatamente la pelle addominale e toracica ai lati del topo, se necessario. Tagliare delicatamente il tessuto connettivo.

Fissare la pelle alla schiuma di polistirene utilizzando aghi di calibro compreso tra 16 e 20, esponendo le ghiandole mammarie attaccate alla superficie inferiore della pelle. Dissezionare una ghiandola alla volta utilizzando pinzette. Sollevare delicatamente la ghiandola mammaria di interesse e tagliare tra la ghiandola e la pelle con forbici piccole e affilate, partendo dall'esterno verso la spina dorsale dell'animale.

Assicurarsi di tagliare con attenzione in modo che nessun frammento di pelle o muscolo rimanga sulla ghiandola. Tutte le ghiandole mammarie possono essere rimosse utilizzando questo protocollo, ma le ghiandole mammarie addominali numero quattro sono le più adatte per il montaggio completo. Dopo aver escisso la ghiandola mammaria dal topo, posizionarla direttamente su un vetrino di vetro.

Cerchi di appiattirla il più possibile. Mantenendo la forma originale in situ, la ghiandola aderirà bene al vetrino. Una volta correttamente distesa in una cappa, fissi la ghiandola immergendo il vetrino in un barattolo di car noise.

Fissare per quattro ore a temperatura ambiente. In alternativa, fissare la ghiandola tutta la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, lavare il tessuto in etanolo al 70% per 15 minuti.

Quindi reidratarlo gradualmente in acqua rimuovendo metà della soluzione di etanolo dal barattolo e sostituendola con acqua doppio distillata. Incubare per cinque minuti. Ripetere tre volte, risciacquare e disperdere in acqua distillata per cinque minuti.

Quindi colorare la ghiandola con ematossilina al carminio di alluminio per tutta la notte a temperatura ambiente; il giorno successivo, rimuovere la soluzione di ematossilina al carminio di alluminio per riutilizzarla e disidratare gradualmente il tessuto colorato mediante bagni seriali di etanolo, ciascuno di cinque minuti. Successivamente, chiarire il tessuto con xilene per tutta la notte; dopo il chiarimento, immergere la ghiandola mammaria nel salicilato di metile, mantenendo il salicilato di metile in cappa fino al momento dell'acquisizione delle immagini. Lo sviluppo della ghiandola mammaria può essere quantificato contando il numero di ramificazioni o rami laterali lungo tratti dei dotti, la lunghezza dei dotti principali oppure valutando il rapporto tra l'area del tessuto epiteliale e quella del tessuto adiposo.

Un secondo saggio utilizzato per valutare lo sviluppo e la funzione della ghiandola mammaria prevede l'esposizione della ghiandola all'ossitocina e la valutazione dell'eiezione del latte nei dotti epiteliali. Per eseguire questo saggio, i cuccioli appena allattati devono essere separati dalla madre e la madre deve essere mantenuta in isolamento per un'ora. Successivamente, si procede al sacrificio della madre ed all'esposizione delle ghiandole mammarie come descritto per la dissezione della ghiandola mammaria.

Tuttavia, lasciarli nell'animale. Iniziare il saggio utilizzando una pipetta di trasferimento per aggiungere uniformemente da tre a cinque millilitri di PBS o della soluzione di ossitocina direttamente sulla ghiandola mammaria di interesse. Per questa procedura, si consiglia di utilizzare le ghiandole toraciche, usando un lato come controllo e l'altro lato per testare l'eiezione del latte.

Incubare le ghiandole per un minuto ed eliminare le soluzioni aspirandole delicatamente con una pipetta trasferibile, monitorando l'ingresso del latte nei dotti mediante registrazione video o acquisendo immagini prima e dopo l'esposizione a PBS o ossitocina. Ecco alcuni esempi di memoria del topo. I dotti epiteliali dei montaggi di ghiandola forata, indicati dalle frecce, e il linfonodo marcato da una punta di freccia sono facilmente osservabili in una ghiandola mammaria intera ben distesa.

Una ghiandola mammaria mal distribuita può staccarsi dal vetrino e collassare, rendendola inutilizzabile. Una ghiandola mammaria escissa in modo improprio può presentare parti mancanti o frammenti di muscolo o pelle residui. L'eiezione del latte indotta da ossitocina può essere osservata nei dotti epiteliali dei piccioni dopo l'esposizione all'ossitocina.

Tuttavia, se le ghiandole sono già piene di latte all'inizio del saggio a causa di un periodo di latenza inadeguatamente lungo dopo l'ultima suzione da parte dei piccoli, è difficile osservare un ulteriore accumulo di latte nelle ghiandole dopo l'esposizione all'ossitocina. D'altro canto, un breve periodo di latenza dopo la suzione impedisce l'accumulo di una quantità sufficiente di latte negli alveoli, rendendo difficile osservarlo adeguatamente nei dotti dopo l'esposizione all'ossitocina, a seguito della dissezione delle ghiandole mammarie. In alternativa al montaggio su supporto o alla valutazione dell'eiezione di latte indotta da ossitocina, le ghiandole mammarie possono essere congelate, tagliate in sezioni crio, e marcate mediante immunomarcatura per un numero qualsiasi di proteine residenti nelle ghiandole mammarie.

In alternativa, le ghiandole possono essere lisate e preparate per il western blotting. Questi due approcci consentono di affrontare questioni fondamentali relative allo sviluppo, alla differenziazione e alla funzione delle ghiandole in un qualsiasi numero di modelli murini che sono stati ingegnerizzati per mancare di geni chiave o per presentare mutazioni nei geni arbor.