Name: Sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da HIV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 50 s
Description: Scopri il sequenziamento del DNA batterico nel sangue periferico di pazienti HIV positivi. Questo metodo identifica la microflora translocante e le sue implicazioni per l'attivazione immunitaria sistemica.

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Siamo grati a Gianni Scimone di assistenza eccellente, con fare video.

La manipolazione dei campioni di sangue con infezione da HIV richiede alcune importanti raccomandazioni. Tutti i campioni di sangue devono essere trasportati in robusto perfetta tenuta. Si deve prestare attenzione al momento del ritiro del campione per evitare la contaminazione esterna del contenitore e di qualsiasi documentazione che accompagna il campione. Tutte le persone che trasformano sangue infetto devono indossare guanti. I guanti devono essere cambiati e lavati le mani dopo il completamento del trattamento del campione. Trattamento di infezione da HIV campioni di sangue deve essere fatto in un armadio di classe II cofano rischio biologico. Ausili meccanici pipettaggio dovrebbero essere usati. L'uso di aghi o altri oggetti da taglio (tra cui ad esempio pipette in vetro o tubi capillari) deve essere limitato alle situazioni in cui non c'è alternativa. Laboratorio superfici devono essere decontaminati con un disinfettante chimico; dopo una fuoriuscita di sangue e quando le attività lavorative sono stati completati. Materiali contaminati utilizzati devono essere decontaminati prima di riutilizzare o devono essere smaltiti correttamente i rifiuti attraverso il percorso clinico. Ogni caso di esposizione professionale a sangue o fluidi potenzialmente infetti (ad esempio, quelli che richiedono precauzioni universali) devono essere trattati come emergenza medica, gli interventi devono essere avviate tempestivamente per essere efficace. Il protocollo prevede 5 giorni per il suo completamento. Il calendario è illustrato dalla Figura 1. Specie batteriche sono identificate con le modalità descritte nella Figura 2. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> 9 ml di sangue intero è disegnato in provette contenenti EDTA. </li><li> Tubi vengono centrifugati a 2000 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente per ottenere il plasma. </li><li> Plasma viene raccolto in una sterile 2 ml Eppendorf-tubo. </li></ol> 2. Estrazione di DNA da campioni di plasma <ol><li> Disinfettare adeguatamente cappuccio, pipette e materiali necessarie per l'esperimento in modo da garantire la sterilità. </li><li> Posizione di tutti i materiali sotto le luci UV per almeno 30 minuti. </li><li> Pulire i guanti con un disinfettante. </li><li> Immergere un paio di asciugamani di carta in etanolo e metterli sotto il cofano. Ogni volta che un suggerimento è stato scartato pulire la pipetta sulla carta assorbente bagnata. </li></ol> Il DNA è estratto utilizzando un kit commerciale seguendo le istruzioni del produttore (Easy-DNA Kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol start="5"><li> 350 ml di plasma sono inseriti in un tubo di 2 ml Eppendorf sterile. </li><li> 350 ml di acqua ultrapura filtrata sono utilizzati come controllo negativo. </li><li> Aggiungere 10 ml di lisozima (1mg/ml) per i campioni. </li><li> Incubare per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 500 ml di Lysis Solution e mescolare delicatamente per i campioni. </li><li> Incubare per 7 minuti a 65 ° C. </li><li> Aggiungere 900 ml di cloroformio ai campioni. </li><li> Energicamente fino a quando i campioni sono presenti una viscosità uniforme. </li><li> Aggiungere 200 ml di soluzione precipitazioni e miscelare vigorosamente. </li><li> Centrifugare i campioni a 10500 rpm per 10 minuti a temperatura ambiente per separare le fasi e formare l'interfaccia. </li><li> Trasferire la fase superiore acquosa ad una provetta fresco contenente 1 ml di etanolo al 100%. </li><li> Centrifugare i campioni a 10500 rpm per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare l'etanolo. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. </li><li> Centrifugare i campioni alla massima velocità per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare l'etanolo. L'etanolo residuo deve essere rimosso con un pipettator. </li><li> Risospendere il pellet in 50 ml di acqua ultrapura. </li><li> Leggi concentrazione di DNA con uno spettrofotometro. </li></ol> 3. Gene rRNA 16S PCR PCR viene eseguita come descritto in precedenza 9. <ol><li> Amplificare il DNA in una miscela di reazione 100 microlitri costituito da 10 ml di tampone 10X PCR, 5 ml di 25 mM MgCl2, 5 ml di 2 mM dNTPs totale, 1 ml di 50 mM fondo RW01 (AACTGGAGGAAGGTGGGGAT), 1 ml di 50 mM fondo DG74 (AGGAGGTGATCCAACCGCA), 34 ml di H20 e 0,5 l di Taq polimerasi (AmpliTaq Oro, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Trasferire il mix di PCR nei filtri in modo da evitare eventuali contaminazioni da batteri Taq polimerasi. </li><li> Filtri di centrifuga (microcontrollore, Millipore, Billerica, MA, USA) per 30 minuti a 500 rcf a 4 ° C. </li><li> Aliquota del mix PCR in base al numero di campioni che devono essere amplificato (positivi e negativi controlli PCR, campioni e acqua estratta). </li><li> Utilizzare le seguenti condizioni termociclatore: 94 ° C per 10 minuti, 40 volte per 1 minuto ogni volta che a 94 ° C, 55 ° C e 72 ° C, ea 10 minuti a 72 ° C. </li><li> Visualizza il prodotto di PCR su un gel di agarosio al 2%. Utilizzare il 100 bp DNA ladder. Dimensione del prodotto PCR è di circa 360 bp (Figura 3). </li></ol> 4. Purificazione dei prodotti PCR Solo i campioni positivi alla PCR deve essere purificato. La purificazione viene eseguita utilizzandouno spot produttore seguendo le istruzioni del kit (PureLink PCR microkit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Aggiungere 4 volumi di Binding Buffer contenente isopropanolo per 1 volume di prodotto della PCR. </li><li> Trasferimento del prodotto PCR con Binding Buffer a una colonna. </li><li> Centrifugare per 1 minuto a 10000 rcf a temperatura ambiente. </li><li> Lavare la colonna con tampone di lavaggio contenenti etanolo. </li><li> Centrifugare per 1 minuto a 10000 rcf a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente per asciugare la membrana di silice e rimuovere eventuali residui di tampone di lavaggio con etanolo. </li><li> Aggiungere 10 ml di acqua ultrapura. </li><li> Incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare alla massima velocità per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere il DNA purificato. </li></ol> 5. Clonazione Lisogenia Broth (LB) Preparazione Piastra <ol><li> Sciogliere 25 gr di mix LB in circa 800 ml di acqua. </li><li> Portare il volume finale a 1 L. </li><li> Aggiungere 15 gr di Bactoagar. </li><li> Autoclave per 20 minuti. </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave, agitare vigorosamente la soluzione nel pallone di mescolare agar fuso. </li><li> Raffreddare la soluzione a 50 ° C. </li><li> Aggiungi ampicillina (50 mg / ml) e agitare fino a completa dissoluzione. </li><li> Versare nelle piastre ad una profondità di circa 3 mm. </li><li> Lasciare le piastre a temperatura ambiente. </li><li> Diffusione X-Gal (40mg/ml) e IPTG (100 mm) su ogni piatto LB ed incubare a 37 ° C fino al momento dell'utilizzo. </li></ol> Cellule competenti Trasformazione La trasformazione è effettuata utilizzando le istruzioni di un produttore commerciale seguenti kit (Topo TA clonazione kit, Invitrogen, Carlsbad CA, USA). <ol><li> Preparare la miscela di reazione clonazione (1-4 ml di prodotto fresco PCR, 1 ml di soluzione di sale, 1 l di vettore e di acqua se necessario). </li><li> Mix di reazione delicatamente e incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare la reazione sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 2 l di reazione clonazione in un flaconcino di cellule competenti e mescolare delicatamente. </li><li> Incubare in ghiaccio per 30 minuti. </li><li> Heat-shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Trasferire immediatamente il tubo in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 250 l di media. </li><li> Chiudere la provetta tighly e agitare il tubo in posizione orizzontale a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Stendere 50 microlitri di ogni trasformazione su un piatto preriscaldata selettiva. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C. </li></ol> Fase di incubazione, colonie bianche e blu si sviluppano su piastre. Colonie bianche sono positivi per l'inserimento dei prodotti PCR e colonie blu sono negativi per l'inserimento dei prodotti PCR. 6. Analisi di sequenziamento Reazione di sequenziamento <ol><li> Un mix è fatto uso di questi reagenti: 2,5 microlitri di DNA, 1 fondo microlitri (5pmol / mL) 1,1 BigDye microlitri (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). </li><li> Condizioni termiche cycler: 96 ° C per 1 minuto, 25 volte per 96 ° C per 10 sec, 55 ° C per 15 sec e 60 ° C per 4 min. </li></ol> Colonna di purificazione <ol><li> Per ogni reazione, preparare una colonna MicroSpin (Qiagen, Milano, Italia). </li><li> Invertire colonna e vortice di miscela di resina. </li><li> Snap dal fondo della colonna, allentare il coperchio ¼ di giro, e la colonna posto in una provetta. </li><li> Centrifuga 3200 rpm per 1 minuto. </li><li> Trasferimento colonna a una provetta pulita. </li><li> Con attenzione l'intera pipetta reazione di sequenziamento della PCR al centro della colonna. </li><li> Centrifuga 3200 rpm per 1 minuto. </li><li> DNA purificato saranno eluite nel tubo (20 ml di acqua ultrapura). </li></ol> Analisi di sequenziamento <ol><li> Caricare il campione purificato (20 l) in 96-pozzetti della piastra. </li><li> Caricare la piastra nel sequencer. Sequencer DNA automatizzato generare una a quattro colori cromatogramma mostra i risultati della corsa di sequenziamento. </li><li> Ingresso la sequenza nucleotidica come una query sul database di sequenze pubblico. La ricerca viene effettuata sui database NCBI e server, con Basic strumento di ricerca locale di allineamento (BLAST). </li><li> Considerare i batteri solo con 98-100% omologie. </li></ol> 7. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Temporale della procedura. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Diagrammi di flusso di tutta la procedura di identificazione batterica. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Gel di agarosio 2% mostrando un'ampia gamma rRNA 16S PCR gene prodotti. Corsia 1 contiene una scala di 100bp DNA, corsia 2 contiene il controllo PCR positivo, corsia 3 mostra il controllo negativo PCR. Corsia 4 mostra i campioni da una paziente sieropositiva, e corsia 5 contiene acqua. Corsia 6 shcampioni OWS da un individuo sano e una reazione negativa PCR; corsia 7 contiene acqua. Solo i pazienti sieropositivi mostra una amplificazione PCR positivo. Acqua ultrapura utilizzata come controllo negativo durante la fase di estrazione, indica l'assenza di contaminazione si è verificato. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Gel di agarosio 0,7% mostrando plasmide estratto con procedura miniprep. Corsia 1 contiene un DNA 1 kilobase scaletta, corsia 2 contiene la colonia azzurra di controllo, corsie da 3 a 12 contengono colonie bianche. Il plasmide dalla colonia blu non contiene l'inserto PCR prodotto. Tutte le 10 colonie bianche contengono plasmide con l'inserto corretta. <img src="/files/ftp_upload/2830/2830fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Mostra un esempio di analisi di sequenziamento batterico nel plasma da un individuo sieropositivo. I nostri risultati dimostrano che la traslocazione microbica in malattia da HIV comporta una flora polimicrobic, che non si vede in soggetti HIV-negativi, suggerendo sostanziale fallimento di immunità intestinale nel controllo traslocazione dei batteri.

<ol><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li>
<li>Macpherson, A. J., Harris, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+commensal+intestinal+bacteria+and+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interactions between commensal intestinal bacteria and the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4, 478-485 (2004).</li>
<li>Kanauchi, O., Mitsuyama, K., Araki, Y., Andoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+intestinal+flora+in+the+treatment+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Modification of intestinal flora in the treatment of inflammatory bowel disease.</a> Curr Pharm Des. 9, 333-346 (2003).</li>
<li>Brenchley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12, 1365-1371 (2006).</li>
<li>Brenchley, J. M., Price, D. A., Douek, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+disease%3A+fallout+from+a+mucosal+catastrophe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV disease: fallout from a mucosal catastrophe.</a> Nat Immunol. 7, 235-239 (2006).</li>
<li>Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199, 1177-1185 (2009).</li>
<li>Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+associated+with+sustained+failure+in+CD4%2B+T-cell+reconstitution+in+HIV-infected+patients+on+long-term+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is associated with sustained failure in CD4+ T-cell reconstitution in HIV-infected patients on long-term highly active antiretroviral therapy.</a> AIDS. 22, 2035-2038 (2008).</li>
<li>Marchetti, G. Role of Microbial Translocation and Immune Hyperactivation in Disease Progression of HIV+ Patients with Preserved CD4 Count in the Absence of ART. The 17th Conference on Reteroviruses and Opportunistic Infections (CROI), San Francisco, CA, USA, , (2010).</li>
<li>Greisen, K., Loeffelholz, M., Purohit, A., Leong, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+and+probes+for+the+16S+rRNA+gene+of+most+species+of+pathogenic+bacteria%2C+including+bacteria+found+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid.</a> J Clin Microbiol. 32, 335-351 (1994).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<p class="jove_content"&gt; Con la presente mostra una PCR / sequenziamento del protocollo per caratterizzare la traslocazione di batteri nel sangue periferico di individui affetti da HIV.</p&gt;<p class="jove_content"Risultati&gt; I più affidabili si ottengono quando si usa plasma raccolto in EDTA contenenti tubi. Dopo il prelievo di sangue, plasma devono essere separati per centrifugazione entro 2 / 3 ore, per evitare emolisi e frammento di degradazione del DNA. I campioni vengono conservati prima a -20 ° C per circa 5 giorni e poi a -80 ° C....

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Easty-DNA Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K 180001 </td><td></td></tr><tr><td> Cloroformio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2432 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7203 </td><td></td><tr/><tr><td> Ultrapura Waer </td><td> Invitrogen </td><td> 10977049 </td><td></td></tr><tr><td> Lisozima </td><td> Fluka </td><td> 62970 </td><td> 10 mg / ml in acqua distillata </td></tr><tr><td> AmpliTaq Gold </td><td> Applied Biosystems </td><td> 26478701 </td><td></td></tr><tr><td> Microcontrollore 100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td><td></td></tr><tr><td> PCR primer </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarosio </td><td> Eppendorf </td><td> C1343 </td><td></td></tr><tr><td> DNA ladder </td><td> Invitrogen </td><td> 15628019 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink PCR micro kit </td><td> Invitrogen </td><td> K310050 </td><td></td></tr><tr><td> Agar LB, polvere </td><td> Invitrogen </td><td> 22700025 </td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ampicillina </td><td> Invitrogen </td><td> 11593027 </td><td> 10 mg / ml in acqua distillata </td></tr><tr><td> X-gal </td><td> Invitrogen </td><td> 15520034 </td><td> 40mg/mL in DMF </td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Invitrogen </td><td> 15529019 </td><td> 100mM in acqua distillata </td></tr><tr><td> Topo TA clonazione kit </td><td> Invitrogen </td><td> K450002 </td><td></td></tr><tr><td> Purelink rapida kit Miniprep plasmidi </td><td> Invitrogen </td><td> K210010 </td><td></td></tr><tr><td> Big colorante </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4337455 </td><td></td></tr><tr><td> DyeEx 2,0 rotazione kit </td><td> Qiagen </td><td> 63204 </td><td></td></tr></tbody></table>

sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da hiv

Sequencing of Bacterial Microflora in Peripheral Blood: our Experience with HIV-infected Patients

La salute del tratto gastrointestinale è fisiologicamente colonizzate da una grande varietà di microbi commensali che influenzano lo sviluppo del umorale e cellulare 1,2 mucose del sistema immunitario. Microbiota è protetta dal sistema immunitario attraverso una forte barriera mucosale. Infezioni e antibiotici sono noti per alterare la barriera sia normale tratto gastrointestinale e la composizione dei batteri residenti, che può causare possibili anomalie immunitarie 3. HIV provoca una breccia nella barriera gastrointestinale con insufficienza progressiva di immunità mucosale e perdite nella circolazione sistemica di bioprodotti batteriche, come lipopolisaccaride e frammenti di DNA batterico, che contribuiscono ad attivazione immunitaria sistemica 4-7. Traslocazione microbica è implicato in HIV / AIDS immunopatogenesi e risposta alla terapia 4,8. Abbiamo voluto caratterizzare la composizione dei batteri translocating nel sangue periferico di pazienti affetti da HIV. Per perseguire il nostro scopo abbiamo istituito una reazione di PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric seguita da una analisi di sequenziamento. In breve, il sangue intero da entrambi i soggetti con infezione da HIV e sano viene usato. Dato che gli individui sani presentano normale omeostasi intestinale non traslocazione della microflora è atteso in questi pazienti. Dopo il prelievo di sangue intero da prelievo venoso e la separazione del plasma, il DNA è estratto dal plasma e utilizzato per eseguire una vasta gamma di reazioni PCR per il gene 16S ribosomiale panbacteric 9. Seguenti analisi purificazione PCR prodotto, la clonazione e il sequenziamento vengono eseguite.

Il nostro esperimento mostra come eseguire una analisi di sequenziamento di specie batteriche translocating nel sangue periferico di pazienti HIV positivi.

Sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da HIV

Il tratto gastrointestinale sano è fisiologicamente colonizzato da un'ampia varietà di microbi commensali che influenzano lo sviluppo della risposta umorale...

Sequenziamento della microflora batterica che transloca nel sangue periferico. La nostra esperienza con pazienti infetti da HIV, sono Marti junior e lavoro come ricercatrice presso la Clinica di Malattie Infettive e Medicina Tropicale dell'Università di Milano in Italia. E ora vi mostreremo esperimenti su come rilevare e sequenziare il DNA batterico dal sangue periferico di pazienti infetti da HIV.Il tratto gastrointestinale sano è colonizzato da una grande varietà di microrganismi commensali che influenzano lo sviluppo del sistema immunitario umorale e cellulare. La microbiota è protetta dal sistema immunitario grazie a una barriera mucosa robusta, che in diverse condizioni cliniche come infezioni, trattamenti antibiotici, complicanze postoperatorie, nonché nei pazienti con carcinoma, pancreatite e malnutrizione, può risultare compromessa. Si verifica un'alterazione del tratto gastrointestinale.L'infezione da HIV provoca una compromissione della barriera gastrointestinale con un progressivo fallimento dell'immunità mucosale e una fuoriuscita nella circolazione sistemica di bioprodotti batterici, come il lipopolisaccaride e frammenti di DNA batterico, che contribuiscono all'attivazione immunitaria sistemica, dimostrando le fasi sperimentali di rilevamento e sequenziamento del DNA batterico. Presenti nel sangue periferico di pazienti infetti da HIV saranno Camilla ti, specializzanda in malattie infettive Esther, io, studentessa di dottorato, e ju MariaI, ricercatrice post-dottorato, tutte frequentanti la clinica di Malattie Infettive e Medicina Tropicale presso l'Università di Milano. Il nostro esperimento ha lo scopo di identificare specie batteriche in campioni di sangue periferico provenienti da pazienti infetti da HIV.Utilizzeremo sangue intero proveniente sia da soggetti infetti da HIV che da soggetti sani, considerando che gli individui sani presentano un'omeostasi intestinale normale. Non ci aspettiamo di osservare microflora in translocazione in questi pazienti. Il sangue intero verrà prelevato dai pazienti e successivamente sarà effettuata la separazione del plasma.Il DNA verrà quindi estratto al fine di eseguire una reazione PCR ampia per il gene ribosomiale 16 s del PCIC. Successivamente, verranno effettuate la purificazione del prodotto PCR, il clonaggio e l'analisi del sequenziamento. Il primo passaggio del nostro esperimento è il prelievo di sangue mediante venipuntura, seguito dalla separazione del plasma.Viene prelevato circa nove millilitri di sangue intero in provette contenenti EDTA. Le provette vengono posizionate in una centrifuga a 2000 giri al minuto per 10 minuti. La centrifugazione a temperatura ambiente consente la separazione del plasma.Ora il DNA verrà estratto dai nostri campioni di plasma. Disinfettare adeguatamente la cappa, le pipette e il materiale necessario per l'esperimento al fine di garantire la sterilità; posizionare tutto il materiale sotto le luci UV per almeno 30 minuti. Spegnere le luci UV, pulire i guanti con un disinfettante, inumidire alcuni fazzoletti di carta con etanolo e posizionarli sotto la cappa ogni volta che si smaltisce una punta. Durante la procedura di estrazione del DNA, pulire la pipetta sui fazzoletti di carta inumiditi.Ora sei pronto per l'estrazione del DNA. Il DNA viene estratto utilizzando un kit commerciale, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, 350 microlitri di plasma vengono posti in una provetta da due ml.Acqua ultrapura viene utilizzata come controllo negativo. 10 microlitri di lisosoma a una concentrazione finale di 1 mg per ml vengono aggiunti ai campioni. I campioni vengono quindi incubati per 30 minuti.A 37 gradi Celsius, la soluzione A, il cloroformio e la soluzione B vengono aggiunti ai campioni secondo le istruzioni successive alla centrifugazione. Appariranno tre fasi distinte. Il soprannatante viene raccolto e aggiunto all'etanolo per favorire la precipitazione del DNA; la concentrazione del DNA viene quindi misurata mediante spettrofotometro.Il passaggio successivo consiste in un'ampia gamma di reazioni di amplificazione PCR per il gene ribosomiale 16S PRIC. La PCR viene eseguita in una stanza dedicata. Viene preparata una miscela di PCR utilizzando questi reagenti. La miscela di PCR viene filtrata per 30 minuti a 500 ×g a quattro gradi Celsius per evitare possibili contaminazioni da polimerasi batterica.La miscela di PCR viene quindi divisa in aliquote, in base al numero di campioni che devono essere amplificati. Ricordare di prevedere aliquote per i controlli di reazione negativi e positivi.LA TERMOCCICLIZZAZIONE è programmata alle seguenti condizioni: 94 gradi Celsius per cinque minuti, 94 gradi Celsius, 55 gradi Celsius, 72 gradi Celsius per un minuto per 40 cicli, 72 gradi Celsius per 10 minuti. La durata media è di tre ore.I prodotti di PCR sono visualizzati su un gel di agarosio al 2%. Questo è un gel di agarosio al 2% che mostra i prodotti di PCR. La prima corsia contiene un marcatore di 100 paia di basi.La seconda corsia, un controllo positivo della PCR. La terza corsia contiene un controllo negativo della PCR. La quarta corsia mostra campioni provenienti da un paziente positivo all'HIV e la quinta corsia contiene la corsia dell'acqua.La corsia sei mostra campioni provenienti da un individuo sano e da una reazione PCR negativa. La corsia sette contiene acqua. La PCR IFICATION è il passaggio successivo.I prodotti della PCR vengono purificati utilizzando un kit commerciale, seguendo le istruzioni del produttore. Per questo passaggio si utilizzano molte colonne contenenti filtri. I risultati della PCR vengono registrati su un foglio di lavoro.Ora procederemo con il clonaggio utilizzando la selezione bianco-blu, una tecnica molecolare che consente il rilevamento dell'inserimento riuscito di DNA in un vettore. Il vettore viene trasformato in cellule competenti. Batteri.Le cellule competenti vengono coltivate in presenza di xal. Se la trasformazione ha successo, la colonia batterica sarà bianca. In caso contrario, la colonia sarà blu.Xal viene utilizzato per indicare se una cellula esprime l'enzima beta-galattosidasi e per visualizzare la trasformazione delle colonie di e coli; l'IPTG induce l'espressione della beta-galattosidasi. Xal e IPTG vengono sparsi su piastre contenenti ampicillina. Viene preparata una miscela di clonaggio contenente prodotti PCR, SALT e un vettore di clonaggio seguendo le istruzioni del produttore.Le cellule di E coli vengono tenute sul ghiaccio. La miscela di clonaggio viene quindi aggiunta alle cellule, che successivamente, dopo uno shock termico, vengono incubate durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, si sviluppano colonie bianche e blu sulle piastre.Le colonie bianche sono positive per i prodotti della PCR. Le colonie blu sono negative per l'inserzione del prodotto della PCR. Vengono selezionate 10 colonie bianche e una colonia blu.Ogni colonia viene posta in due millilitri di terreno liquido LB per la crescita. Le colonie in terreno aggiunto di ampicillina vengono incubate tutta la notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, le colonie cresciute durante la notte vengono utilizzate per l'estrazione del plasmide mediante un kit commerciale per mini-prep.Mini colonne contenenti filtri vengono utilizzate nel passaggio successivo all'estrazione del plasmide; i plasmidi vengono visualizzati su un gel di AROS allo 0,7%. Questo è un gel di AROS allo 0,7% che mostra i prodotti di una mini prep. La prima corsia contiene un marcatore di 1 chilobase.La seconda corsia contiene la colonia di controllo blu. Le corsie da tre a dodici contengono colonie bianche. I risultati vengono registrati con un foglio di lavoro; successivamente segue il sequenziamento, quindi i plasmidi vengono amplificati.Viene preparata una miscela utilizzando questi reagenti. La miscela di PCR viene suddivisa in aliquote in base al numero di campioni che devono essere amplificati. Il termociclaggio è programmato alle seguenti condizioni: 96 gradi Celsius per un minuto, 96 gradi Celsius per 10 secondi, 50 gradi Celsius per cinque secondi, 60 gradi Celsius per quattro minuti.Per 25 cicli. La durata media è di circa un'ora. Dopo l'amplificazione, i prodotti della PCR vengono purificati utilizzando colonnine contenenti filtro.I prodotti purificati vengono caricati su una piastra, che successivamente viene inserita in un sequenziatore. Una volta ottenuta la sequenza, questa viene analizzata mediante blast e le specie batteriche di ciascuna colonia vengono identificate. Le colonie che mostrano una sequenza con omologia dal 98% al 100% sono considerate positive.Questo è un esempio di sequenziamento batterico nel plasma di un singolo individuo positivo all'HIV. I nostri risultati mostrano che la traslocazione microbica nella malattia da HIV coinvolge una flora polimicrobica. Abbiamo dimostrato che i pazienti infetti da HIV presentano una flora microbica polimicrobica elevata nella circolazione sistemica.Il DNA batterico nel sangue periferico era al di sotto del limite di rilevamento nei soggetti sani sieronegativi per HIV, il che potrebbe riflettere l'integrit&agrave; del tratto gastrointestinale. La nostra ricerca &egrave; ora concentrata sul comprendere e indagare il possibile ruolo della microflora nel sangue periferico, nella patogenesi immunologica dell'HIV e, eventualmente, nella risposta alla terapia.

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Tropismo dell'HIV può essere dedotta dalla regione V3 della busta virale. V3 è amplificato mediante PCR in triplice copia tramite nested RT-PCR, in sequenza, e interpretato utilizzando il software bioinformatico. I campioni con con sequenza di 1 o più (s) con punteggi bassi G2P sono classificati come non-R5 virus.

Inferenza genotipica del virus HIV-1 Tropismo utilizzo basati sulla popolazione sequenziamento del V3

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infezione da modello per lo studio<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 in Interazioni umane Le cellule immunitarie primarie derivate da monociti

Utilizzando fibrosi cistica vie respiratorie come esempio, il manoscritto presenta un flusso di lavoro comprendente una combinazione di approcci metagenomiche e metatranscriptomic per caratterizzare la comunità microbiche e virali in campioni animali-associata.

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La co-infezione umana è difficile da replicare in vitro. Tuttavia, i parassiti della malaria umana possono essere facilmente coltivati in vitro, così come le cellule mononucleate del sangue periferico umano appena isolate e naturalmente infettate dall'HIV. Ciò fornisce un modello eccellente per studiare le risposte immunitarie precoci ai parassiti della malaria nel contesto della co-infezione da HIV.

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Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l'interfaccia liquido-aria.

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Full-Length individuo proviral sequenziamento (Flip) fornisce un metodo efficiente e ad alta produttività per l'amplificazione e sequenziamento del singolo, vicino a full-length provirus di HIV-1 (intatto e difettoso) e permette per la determinazione del loro potenziale replica-competenza. Salti mortali supera i limiti delle precedenti analisi progettate per sequenziare il serbatoio latente di HIV-1.

Amplificazione del vicino full-length provirus di HIV-1 per il sequenziamento di nuova generazione

Descriviamo un metodo per la lavorazione del fluido di lavaggio bronchoalveolar e corrisponde al sangue periferico di individui cronicamente affetti da HIV sulla terapia antiretrovirale per valutare i serbatoi polmonari di HIV. Questi metodi portano all'acquisizione di cellule T CD4 altamente pure e macrofagi alveolar che possono successivamente essere utilizzati per immunofenofizzazione e quantificazioni HIV DNA/RNA mediante reazione a catena di polimerasi ultrasensibili.

Trattamento del bronchoalveolar Lavage Fluid e del sangue abbinato per il macrofago alveoere e CD4- Immunofenotyping a cellule T e valutazione del serbatoio dell'HIV

Presentato qui è un protocollo ottimizzato per isolare, coltivare, tradurre e differenziare i monociti primari umani da individui infettati dall'HIV e dai controlli sani.

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Il latte materno trasmette il virus dell'immunodeficienza umana (HIV), anche se solo il 15% dei neonati allattati al seno da madri affette da HIV si infetta. I neonati allattati al seno ingeriscono 105x 108 leucociti materni al giorno, anche se queste cellule sono poco studiate. Qui descriviamo l'isolamento del latte materno leucociti e un'analisi della loro capacità fagocitica.

Isolamento dei leucociti dal latte materno umano per l'uso in un saggio di fagocitosi cellulare dipendente da anticorpi sui bersagli HIV

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