Sequenziamento di microflora batterica nel sangue periferico: la nostra esperienza con pazienti affetti da HIV

Sequenziamento della microflora batterica che transloca nel sangue periferico. La nostra esperienza con pazienti infetti da HIV, sono Marti junior e lavoro come ricercatrice presso la Clinica di Malattie Infettive e Medicina Tropicale dell'Università di Milano in Italia. E ora vi mostreremo esperimenti su come rilevare e sequenziare il DNA batterico dal sangue periferico di pazienti infetti da HIV.

Il tratto gastrointestinale sano è colonizzato da una grande varietà di microrganismi commensali che influenzano lo sviluppo del sistema immunitario umorale e cellulare. La microbiota è protetta dal sistema immunitario grazie a una barriera mucosa robusta, che in diverse condizioni cliniche come infezioni, trattamenti antibiotici, complicanze postoperatorie, nonché nei pazienti con carcinoma, pancreatite e malnutrizione, può risultare compromessa. Si verifica un'alterazione del tratto gastrointestinale.

L'infezione da HIV provoca una compromissione della barriera gastrointestinale con un progressivo fallimento dell'immunità mucosale e una fuoriuscita nella circolazione sistemica di bioprodotti batterici, come il lipopolisaccaride e frammenti di DNA batterico, che contribuiscono all'attivazione immunitaria sistemica, dimostrando le fasi sperimentali di rilevamento e sequenziamento del DNA batterico. Presenti nel sangue periferico di pazienti infetti da HIV saranno Camilla ti, specializzanda in malattie infettive Esther, io, studentessa di dottorato, e ju MariaI, ricercatrice post-dottorato, tutte frequentanti la clinica di Malattie Infettive e Medicina Tropicale presso l'Università di Milano. Il nostro esperimento ha lo scopo di identificare specie batteriche in campioni di sangue periferico provenienti da pazienti infetti da HIV.

Utilizzeremo sangue intero proveniente sia da soggetti infetti da HIV che da soggetti sani, considerando che gli individui sani presentano un'omeostasi intestinale normale. Non ci aspettiamo di osservare microflora in translocazione in questi pazienti. Il sangue intero verrà prelevato dai pazienti e successivamente sarà effettuata la separazione del plasma.

Il DNA verrà quindi estratto al fine di eseguire una reazione PCR ampia per il gene ribosomiale 16 s del PCIC. Successivamente, verranno effettuate la purificazione del prodotto PCR, il clonaggio e l'analisi del sequenziamento. Il primo passaggio del nostro esperimento è il prelievo di sangue mediante venipuntura, seguito dalla separazione del plasma.

Viene prelevato circa nove millilitri di sangue intero in provette contenenti EDTA. Le provette vengono posizionate in una centrifuga a 2000 giri al minuto per 10 minuti. La centrifugazione a temperatura ambiente consente la separazione del plasma.

Ora il DNA verrà estratto dai nostri campioni di plasma. Disinfettare adeguatamente la cappa, le pipette e il materiale necessario per l'esperimento al fine di garantire la sterilità; posizionare tutto il materiale sotto le luci UV per almeno 30 minuti. Spegnere le luci UV, pulire i guanti con un disinfettante, inumidire alcuni fazzoletti di carta con etanolo e posizionarli sotto la cappa ogni volta che si smaltisce una punta. Durante la procedura di estrazione del DNA, pulire la pipetta sui fazzoletti di carta inumiditi.

Ora sei pronto per l'estrazione del DNA. Il DNA viene estratto utilizzando un kit commerciale, seguendo le istruzioni del produttore. In breve, 350 microlitri di plasma vengono posti in una provetta da due ml.

Acqua ultrapura viene utilizzata come controllo negativo. 10 microlitri di lisosoma a una concentrazione finale di 1 mg per ml vengono aggiunti ai campioni. I campioni vengono quindi incubati per 30 minuti.

A 37 gradi Celsius, la soluzione A, il cloroformio e la soluzione B vengono aggiunti ai campioni secondo le istruzioni successive alla centrifugazione. Appariranno tre fasi distinte. Il soprannatante viene raccolto e aggiunto all'etanolo per favorire la precipitazione del DNA; la concentrazione del DNA viene quindi misurata mediante spettrofotometro.

Il passaggio successivo consiste in un'ampia gamma di reazioni di amplificazione PCR per il gene ribosomiale 16S PRIC. La PCR viene eseguita in una stanza dedicata. Viene preparata una miscela di PCR utilizzando questi reagenti. La miscela di PCR viene filtrata per 30 minuti a 500 ×g a quattro gradi Celsius per evitare possibili contaminazioni da polimerasi batterica.

La miscela di PCR viene quindi divisa in aliquote, in base al numero di campioni che devono essere amplificati. Ricordare di prevedere aliquote per i controlli di reazione negativi e positivi.

LA TERMOCCICLIZZAZIONE è programmata alle seguenti condizioni: 94 gradi Celsius per cinque minuti, 94 gradi Celsius, 55 gradi Celsius, 72 gradi Celsius per un minuto per 40 cicli, 72 gradi Celsius per 10 minuti. La durata media è di tre ore.

I prodotti di PCR sono visualizzati su un gel di agarosio al 2%. Questo è un gel di agarosio al 2% che mostra i prodotti di PCR. La prima corsia contiene un marcatore di 100 paia di basi.

La seconda corsia, un controllo positivo della PCR. La terza corsia contiene un controllo negativo della PCR. La quarta corsia mostra campioni provenienti da un paziente positivo all'HIV e la quinta corsia contiene la corsia dell'acqua.

La corsia sei mostra campioni provenienti da un individuo sano e da una reazione PCR negativa. La corsia sette contiene acqua. La PCR IFICATION è il passaggio successivo.

I prodotti della PCR vengono purificati utilizzando un kit commerciale, seguendo le istruzioni del produttore. Per questo passaggio si utilizzano molte colonne contenenti filtri. I risultati della PCR vengono registrati su un foglio di lavoro.

Ora procederemo con il clonaggio utilizzando la selezione bianco-blu, una tecnica molecolare che consente il rilevamento dell'inserimento riuscito di DNA in un vettore. Il vettore viene trasformato in cellule competenti. Batteri.

Le cellule competenti vengono coltivate in presenza di xal. Se la trasformazione ha successo, la colonia batterica sarà bianca. In caso contrario, la colonia sarà blu.

Xal viene utilizzato per indicare se una cellula esprime l'enzima beta-galattosidasi e per visualizzare la trasformazione delle colonie di e coli; l'IPTG induce l'espressione della beta-galattosidasi. Xal e IPTG vengono sparsi su piastre contenenti ampicillina. Viene preparata una miscela di clonaggio contenente prodotti PCR, SALT e un vettore di clonaggio seguendo le istruzioni del produttore.

Le cellule di E coli vengono tenute sul ghiaccio. La miscela di clonaggio viene quindi aggiunta alle cellule, che successivamente, dopo uno shock termico, vengono incubate durante la notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, si sviluppano colonie bianche e blu sulle piastre.

Le colonie bianche sono positive per i prodotti della PCR. Le colonie blu sono negative per l'inserzione del prodotto della PCR. Vengono selezionate 10 colonie bianche e una colonia blu.

Ogni colonia viene posta in due millilitri di terreno liquido LB per la crescita. Le colonie in terreno aggiunto di ampicillina vengono incubate tutta la notte a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, le colonie cresciute durante la notte vengono utilizzate per l'estrazione del plasmide mediante un kit commerciale per mini-prep.

Mini colonne contenenti filtri vengono utilizzate nel passaggio successivo all'estrazione del plasmide; i plasmidi vengono visualizzati su un gel di AROS allo 0,7%. Questo è un gel di AROS allo 0,7% che mostra i prodotti di una mini prep. La prima corsia contiene un marcatore di 1 chilobase.

La seconda corsia contiene la colonia di controllo blu. Le corsie da tre a dodici contengono colonie bianche. I risultati vengono registrati con un foglio di lavoro; successivamente segue il sequenziamento, quindi i plasmidi vengono amplificati.

Viene preparata una miscela utilizzando questi reagenti. La miscela di PCR viene suddivisa in aliquote in base al numero di campioni che devono essere amplificati. Il termociclaggio è programmato alle seguenti condizioni: 96 gradi Celsius per un minuto, 96 gradi Celsius per 10 secondi, 50 gradi Celsius per cinque secondi, 60 gradi Celsius per quattro minuti.

Per 25 cicli. La durata media è di circa un'ora. Dopo l'amplificazione, i prodotti della PCR vengono purificati utilizzando colonnine contenenti filtro.

I prodotti purificati vengono caricati su una piastra, che successivamente viene inserita in un sequenziatore. Una volta ottenuta la sequenza, questa viene analizzata mediante blast e le specie batteriche di ciascuna colonia vengono identificate. Le colonie che mostrano una sequenza con omologia dal 98% al 100% sono considerate positive.

Questo è un esempio di sequenziamento batterico nel plasma di un singolo individuo positivo all'HIV. I nostri risultati mostrano che la traslocazione microbica nella malattia da HIV coinvolge una flora polimicrobica. Abbiamo dimostrato che i pazienti infetti da HIV presentano una flora microbica polimicrobica elevata nella circolazione sistemica.

Il DNA batterico nel sangue periferico era al di sotto del limite di rilevamento nei soggetti sani sieronegativi per HIV, il che potrebbe riflettere l'integrità del tratto gastrointestinale. La nostra ricerca è ora concentrata sul comprendere e indagare il possibile ruolo della microflora nel sangue periferico, nella patogenesi immunologica dell'HIV e, eventualmente, nella risposta alla terapia.