Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il grado di polarità degli ovociti in metafase due dopo una manipolazione sperimentale. Iniziare raccogliendo ovociti completamente sviluppati da topi femmine sessualmente mature. Successivamente, microiniettare gli ovociti con il materiale scelto per alterare la proteina di interesse e maturare gli ovociti in vitro fino alla metafase della meiosi due. Poi, stimolare la dispersione dei cromosomi nell'ovocita mediante trattamento con mantro, che determina la formazione di un fuso monopolare.

In definitiva, questi risultati possono rappresentare lo stato di ploidia dell'ovocita mediante immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia della riproduzione e della segregazione cromosomica, come la comprensione dei meccanismi molecolari che portano a un'alterazione della fluidità. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la tecnica di microiniezione è difficile da apprendere, in quanto diversi passaggi sono complessi da descrivere per iscritto. Iniettare intraperitonealmente nei topi femmina sessualmente maturi 5 UI di gonadotropina sierica di topo gravido per massimizzare il numero di follicoli antrali isolati da ciascun animale.

Circa 48 ore dopo la somministrazione di PMSG, riscaldare tre millilitri per topo di mezzo di raccolta a 37 gradi Celsius ed equilibrare. Un millilitro di mezzo di coltura per almeno un'ora. Preparare gocce microscopiche di ciascun mezzo in una piastra di Petri e ricoprirle con olio minerale.

Ora posizionare la piastra con il mezzo di coltura nell'incubatore e la piastra con il mezzo di raccolta su un riscaldatore per vetrini. Sacrificare il topo, dissezionare le ovaie e posizionarle in un bicchiere da orologio contenente mezzo di raccolta preriscaldato.

Utilizzando una siringa per insulina da un millilitro, fissare le ovaie alla piastra e rilasciare i follicoli antrali perforandoli più volte con aghi da 27 gauge fissati insieme. Sotto un microscopio stereoscopico, raccogliere i complessi cumulus-oociti mediante una pipetta di vetro azionata con la bocca. Raccogliere esclusivamente follicoli antrali di grandi dimensioni, evitando i follicoli preantrali più piccoli e gli oociti denudati.

Trasferire i complessi in una microgoccia di mezzo di raccolta preparato utilizzando una pipetta piccola leggermente più larga del diametro dell'ovocita. Staccare le cellule del cumulo dai complessi. Trasferire gli ovociti denudati con una pipetta più grande in una microgoccia di mezzo di coltura.

Lasciare che gli oociti si riprendano per almeno un'ora nell'incubatrice prima della manipolazione. Preparare le pipette per iniezione tirando tubi capillari in vetro borosilicato con un estrattore meccanico. Rimuovere la camera contenente il mezzo da una lamella con pozzetto singolo.

Per creare una piattaforma di microiniezione, posizionare una goccia di cinque microlitri di mezzo di raccolta il più vicino possibile a una goccia di 0,5 microlitri di SIR N-A-C-R-N-A o morfologico per materiale di iniezione di oligonucleotidi, coprire con olio minerale e posizionare sul palchetto del microscopio. Inserire le pipette di iniezione e di ritenzione nei supporti e posizionarle nella goccia di mezzo di raccolta. Accendere le bombole di azoto collegate al pico iniettore e al tavolo antivibrazione.

Aprire delicatamente la punta della pipetta di iniezione picchiettandola leggermente contro la pipetta di ritenzione mentre la si riempie con il mezzo. Trasferire da cinque a dieci siti oh dall'incubatore alla goccia di mezzo di raccolta sulla piattaforma. Impostare ora i parametri del pico iniettore su un volume di iniezione compreso tra cinque e dieci picolitri premendo clear.

Spostare l'ago di iniezione sulla goccia di materiale e riempirlo. Riportarlo quindi sulla goccia di mezzo. Utilizzare la pipetta di ritenzione per catturare un ovocita e allineare l'ovocita, l'ago di iniezione e la pipetta di ritenzione lungo l'asse x.

Con un ingrandimento maggiore, avanzare la pipetta di iniezione attraverso l'ovocita, avendo cura di evitare il nucleo. Una volta perforata la membrana plasmatica, premere "inject"; dopo l'iniezione, ritirare l'ago, rilasciare l'ovocita e ripetere l'operazione. Dopo aver iniettato tutti gli ovociti, riporli nell'incubatrice per mantenerli nel mezzo di coltura per il tempo desiderato, che di solito varia da 12 a 24 ore.

Quindi lavare le cellule attraverso diverse gocce di CZB e trasferirle in una microgoccia di CZB sotto olio, incubando per 16 ore per completare la maturazione alla metafase della seconda meiosi. Aggiungere 750 microlitri di CZB contenenti 100 Micromolar Mastri in una pozzetta di una piastra per coltura organotissutale che contenga acqua nell'anello esterno. Lavare ora le uova attraverso diverse gocce di CZB con mastri, quindi trasferirle nella piastra per coltura organotissutale e incubare per un'ora.

Fissare le uova in una capsula di Petri contenente paraformaldeide al 2% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire le uova nella soluzione di blocco e conservare a quattro gradi Celsius fino all'elaborazione delle uova permeabilizzate per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi eseguire diversi lavaggi con grandi volumi di soluzione di blocco.

Eseguire il resto della procedura sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti protetta dalla luce in una camera umidificata. A temperatura ambiente, trasferire le uova in gocce da 25 microlitri di soluzione bloccante per 15 minuti. Successivamente, per etichettare i centromeri, trasferire le uova in una goccia di soluzione bloccante contenente Crest Antiserum in una diluizione di uno a 40 e incubare per almeno un'ora.

Quindi lavare con tre gocce di soluzione di blocco, incubando 15 minuti in ciascuna. Trasferire le uova in una goccia di soluzione di blocco contenente l'anticorpo coniugato con fluoro quattro e incubare per un'ora. Lavare due volte con soluzione di blocco per rilevare i cromosomi.

Incubare in una diluizione 1:5.000 di cytx green e soluzione di blocco, quindi montare i campioni in cinque microlitri di vector shield. Posizionare quattro piccole gocce di vaselina nelle posizioni previste per gli angoli del coprioggetto per evitare lo schiacciamento delle uova. Posizionare il coprioggetto e sigillare con smalto per unghie; conservare in una scatola per vetrini a quattro gradi Celsius fino all'analisi mediante microscopia confocale. Durante l'acquisizione con un obiettivo da 100x, acquisire passi di 0,4 micrometri nel piano Z e immagini dell'intera regione del metafase contando il centromero utilizzando software di acquisizione come Image J del NIH. Le uova di topo euploidi contengono 20 coppie di cinetocori, per un totale di 40 punti in questa proiezione Z di un uovo in metafase II. Il DNA è colorato in verde e i cinetocori K sono colorati in rosso.

Le frecce indicano due bracci cromatidici distinti che mostrano un sovrapposizione al cinetocoro numero 17 e al numero 18, a seguito della procedura di microiniezione. Altri metodi, come il Western blotting, la PCR in tempo reale, la valutazione della configurazione del fuso e dell'allineamento dei cromosomi e la fecondazione in vitro, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo la perturbazione della proteina di interesse influisce sulla maturazione mitotica e sul potenziale di sviluppo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare i siti specifici e valutare il PLO della metafase due x.