Name: Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Impara la microiniezione di ovociti mouse per valutare la ploidia in biologia riproduttiva. Questo metodo consente di studiare la segregazione cromosomica e i meccanismi dell'aneuploidia.

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Questo lavoro è stato condotto nel laboratorio di Richard M. Schultz &#39;s. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Michael Lampson per concettualizzare il centromero-conteggio saggio e l&#39;accesso al suo microscopio confocale. Teresa Chiang e Francesca Duncan assistito ad ottimizzare il centromero-conteggio test. Paula Stein è supportato da HD022681 (a RMS) e Karen Schindler è supportato da HD055822.

1. Topo ovocita collezione <ol><li> Per massimizzare il numero di follicoli antrali isolati gli uni dagli mouse, intraperitoneale iniettare topi femmina sessualmente matura (usiamo di 6 settimane di età CF-1 nei topi da Harlan) con 5 UI di siero di cavalla gravida di gonadotropina (PMSG). </li><li> Preparare il mezzo di raccolta (MEM / PVP) (3 ml / mouse) aggiungendo milrinone a 2,5 micron e riscaldarlo a 37 ° C. Milrinone è un inibitore della fosfodiesterasi che mantiene arresto meiotico, una volta gli ovociti vengono rimossi dai follicoli. In alternativa, 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) (0,2 mm) o dibutyryl-adenosina monofosfato ciclico (dbcAMP) (100 mg / ml) può essere utilizzato. Preparare il terreno di coltura con l'aggiunta di glutamina (1 mm) e milrinone (2,5 mM) a 1 ml di CZB e lasciarlo equilibrare nell'incubatrice per almeno un'ora. Impostare il microgocce di ognuno in una piastra di Petri e sovrapposizione con olio minerale. Il piatto CZB viene messo in incubatrice mentre la MEM / PVP piatto rimane al di fuori di una diapositiva più caldo. Altra raccolta e mezzo di coltura che sono disponibili in commercio (M2 e M16 da supporti speciali o Sigma) sono utilizzati di routine. </li><li> Circa 48 ore dopo PMSG adescamento, il sacrificio del mouse utilizzando CO 2 sedazione seguita da dislocazione cervicale, sezionare le ovaie e metterli in un vetro d'orologio contenente preriscaldata MEM / PVP + milrinone (MEM / PVP + M). </li><li> Utilizzando una siringa da insulina da 1 ml, ancora le ovaie al piatto e rilasciare i follicoli antrali di pungere più volte con 27-gauge (o cucire) aghi che sono fissati insieme. </li><li> Mentre si guarda attraverso un microscopio dissezione, raccogliere complessi cumulo-ovocita usando una bocca a comando pipetta di vetro. E 'utile avere un microscopio con un sacco di contrasto. In alternativa, il supporto contenente i tessuti e le cellule possono essere pipettati su un coperchio di un piatto di plastica Petri. Solo raccogliere grandi follicoli antrali e non più piccoli pre-antrale follicoli o ovociti denudati. Una volta raccolti, i complessi trasferimento ad un MicroDrop di MEM / PVP + M che si trova sulla scorrimento più calde e sotto olio. </li><li> Utilizzando una pipetta di piccole dimensioni (leggermente più grande del diametro del ovocita), pipettare su e giù per i complessi di staccare cellule del cumulo. Trasferire gli ovociti denudata con una pipetta in un più ampio MicroDrop di CZB + milrinone (CZB + M) e posto nell'incubatrice. </li><li> Permettono di recuperare gli ovociti per almeno 1 ora in incubatrice prima della manipolazione. </li></ol> 2. Microiniezione ovocitaria <ol><li> Fai pipette iniezione tirando in vetro borosilicato tubo capillare in un estrattore meccanico. Usiamo un Flaming-Brown micropipetta estrattore (modello P-97) con le seguenti impostazioni: P = 500, di calore = 300, Pull = 150, Vel = 100, Tempo = 150. </li><li> Preparare la piattaforma microiniezione mettendo una goccia 5 ml di MEM / PVP + M il più vicino possibile ad una goccia 0,5 ml di materiale iniezione di scelta (siRNA per esempio, cRNA, oligonucleotide morfolino, ecc) su un 1-scivolo e da camera che ha la camera dei media rimosso. Coprire con olio minerale e posto sul palco microscopio (Fig. 1). </li><li> Luogo di iniezione e pipette tenendo nei supporti e la posizione nella goccia di MEM / PVP + M. Accendere i serbatoi di azoto che sono collegati al picoinjector e anti-vibrazioni tavolo. Aprire la punta della pipetta di iniezione con delicatezza toccando contro la pipetta tenendo mentre il riempimento con il mezzo. Se l'apertura è troppo grande, il mezzo si muove dentro e fuori rapidamente e l'ago si uccidono la cellula. Pipette con troppo piccolo di un'apertura spesso intasano facilmente. </li><li> Ovociti trasferimento (5-10) dal termostato al MEM / PVP + M cadere sulla piattaforma. Prima di iniettare, impostare la picoinjector. Noi utilizzare i seguenti parametri sul nostro picoinjector (Modello PLI-100 da Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, tempo = 3s. Ciò si traduce in un volume di iniezione di 5-10 pL. </li><li> Tenendo premuto CLEAR, spostare l'ago per l'iniezione per la caduta di materiale e di riempimento. Restituirlo alla caduta media. </li><li> Utilizzare la pipetta di partecipazione agli catturare un ovocita e allineare l'ago di iniezione, degli ovociti e pipetta tenendo lungo l'asse delle ascisse. </li><li> In alto ingrandimento, far avanzare la pipetta di iniezione attraverso l'ovocita facendo attenzione ad evitare il nucleo. Una volta che la membrana plasmatica è trafitto, premere iniettare. Dopo l'iniezione, ritirare l'ago. Rilasciare l'ovocita e ripetere. Una volta che tutti gli ovociti vengono iniettati, li riporta ai incubatrice. Tenere in CZB + M per quantità di tempo desiderato, questo tempo dipende lo scopo sperimentale (siRNA e cioè knockdown morfolino (fino a 24 ore), l'iperespressione (3-12 h)). Si prega di notare che l'incubazione più lungo di 24 ore sarà compromesso maturazione meiotica. </li></ol> 3. Maturazione degli ovociti <ol><li> Dopo l'incubazione lavare gli ovociti attraverso alcune gocce di CZB (media maturazione) e trasferirlo in una MicroDrop di media stagionatura sotto olio e mettere in incubatrice. </li><li> Consentire 16 h per t completa maturazione o metafase della meiosi II. </li></ol> 4. Ploidia analisi <ol><li> Preparare CZB + monastrol (100 mM) e il luogo 750 microlitri nel pozzetto di un piatto cultura organo che ha l'acqua nell'anello esterno. </li><li> Lavare le uova con alcune gocce di CZB + monastrol e trasferirli nel piatto cultura organo. Posto in incubatrice per 1 h. </li><li> Fissare le uova con il trasferimento in un vetro d'orologio contenente il 2% paraformaldeide in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferimento in un altro vetro d'orologio con il blocco soluzione. Questo piatto può essere conservato a 4 ° C fino elaborati. </li><li> Trasferimento a soluzione permeabilizzazione (PBS + 0,3% di BSA + TritonX-100 0,1% + 0,02% NaN 3) in un vetro d'orologio per 15 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare attraverso diversi grandi volumi di soluzione di blocco (PBS + 0,3% di BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> Il resto della procedura viene eseguita sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti in una camera umidificata a temperatura ambiente che è protetta dalla luce. Le gocce (~ 25 mL) sono collocati all'interno delle rientranze circolare. Trasferimento uova a bloccare una soluzione per 15 minuti. </li><li> Per centromeri etichetta, uova trasferimento in una goccia di soluzione contenente il blocco CREST anti-siero a 1:40. Incubare per almeno 1 h. Lavare con 3 gocce di soluzione di blocco, incubare 15 minuti ciascuno. </li><li> Trasferimento uova per una goccia di soluzione contenente il blocco Cy5-o-Alexa Fluor-594-coniugato anti-IgG umane (1:200) e incubare per 1h. Ripetere il lavaggio passi come sopra tranne per l'ultimo passo, includono Sytox Verde (1:5.000) nella soluzione bloccante per rilevare cromosomi. Montare in 5 ml di Vectashield. Per evitare lo schiacciamento delle uova, mettere 4 piccole macchie di vaselina negli angoli di dove il coprioggetto sarà. Collocare un coprioggetto sopra e sigillare con smalto. Conservare in una scatola di scorrimento a 4 ° C fino a quando l'elaborazione tramite microscopia confocale. </li><li> Mentre l'imaging con un obiettivo 100X, cattura 0,4 micron passi nella Z-plane e di immagine dell'intera regione del mandrino metafase. Conte centromeri utilizzando software di imaging come immagine J (NIH). </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: Figura 2 è un Z-proiezione da un uovo euploid. In metafase di MII, uova euploid topo contengono 20 coppie di cromosomi e quindi hanno 40 centromeri. Occasionalmente cromosomi non riescono a diffondersi nonostante il trattamento monastrol. Questa situazione rende difficile contare affidabile centromeri e quindi non includono queste uova nelle nostre analisi. Occasionalmente, può essere difficile determinare se un CREST-immunoreattive "spot" è di 1 o 2 centromeri. Utilizzando programmi come J immagine è utile perché si può analizzare ogni Z-sezione mentre notando attentamente l'orientamento dei cromosomi, il numero di sezioni in cui viene rilevato un "spot" e l'intensità dei pixel i "punti" hanno. A seconda di dove il fuso meiotico è posizionato rispetto al corpo polare, le regioni del DNA possono sovrapporsi e questi campioni non devono essere inclusi nell'analisi. Non manipolata, in vivo, uova ovulato dai topi riproduttivo giovani hanno bassi tassi di aneuploidia (~ 1-2%). Tuttavia, per motivi non compresi, microiniezione e nelle procedure di maturazione in vitro possono aumentare questo tasso verso l'alto del 10%. Pertanto, è fondamentale che gli ovociti iniettati di controllo sono inclusi in ogni studio microiniezione. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Piatto microiniezione impostare. Una diapositiva da camera con 5 gocce l di MEM / PVP + M appena sopra 0.5μl gocce di soluzione di iniezione. Coprire con olio minerale. In questo esempio ci sono 3 gocce per 3 diverse soluzioni di iniezione e la diapositiva è seduto sul palco di un microscopio. A sinistra si trova l'ago microiniezione e di destra è la pipetta in mano. Notare che vi è un riflesso della porta-aghi. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Risultati ploidia. A Z-proiezione di un uovo euploid metafase II. Il DNA è colorato in verde e cinetocori sono colorati in rosso. Le frecce indicano 2 bracci distinti cromatidi indicando che cinetocori (# 17 e # 18) si sovrappongono. Uova di topo Euploid contengono 20 coppie cinetocoro (40 totale "macchie"). Un uovo aneuploidi conterrebbe alcuna variazione su questo numero. Se questa procedura sono stati condotti su ovociti metafase MI, ci sarebbero 40 paia cinetocoro (80 totale "macchie"). <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabella 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabella 1"> Tabella 1. Ricetta per mezzo di raccolta e di microiniezione (MEM / PVP + M). Tutti i materiali sono embrio-cultura grado e di Sigma-Aldrich. Filtro sterilizzare attraverso 0.22μm filtri PVDF (usiamo Stericups Milipore) e conservare a 4 ° C. iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg "alt =" Tabella 2 "/&gt; Tabella 2. Ricetta per le medie CZB. Tutti i materiali sono embrio-cultura grado e di Sigma-Aldrich. Filtro sterilizzare attraverso 0.22μm filtri PVDF (usiamo Stericups Milipore) e conservare a 4 ° C.

<ol><li>Hunt, P. A., Hassold, T. J. Science. 296 (5576), 2181-2181 (2002).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. Hum Mol Genet. 16 Spec No. 2, R203-R203 (2007).</li>
<li>Chatot, C. L., Ziomek, C. A., Bavister, B. D. Journal of reproduction and fertility. 86 (2), 679-679 (1989).</li>
<li>Schultz, M. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchultz%2C+MR+%22Oogenesis+and+the+control+of+meiotic+maturation%22">Oogenesis and the control of meiotic maturation</a>. , Cambridge University Press. New York. (1986).</li>
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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microiniezione degli ovociti è un metodo potente per studiare i meccanismi che regolano la maturazione meiotica 10,11, 12, 13. Questo metodo offre un modo economico per verificare ipotesi prima di effettuare un grande investimento per lo sviluppo di modelli di topi transgenici e mirati. Raccolta degli ovociti e tecniche di microiniezione richiedono più tempo per padroneggiare procedure tipiche di biologia cellulare. Ostacoli specifici con raccolta spesso includono il controllo della pipetta bocca, tirando la corretta dimensione pipetta di vetro per la raccolta e la rimozione delle cellule somatiche e aumentando la velocità di raccolta per ridurre al minimo il tempo in cui gli ovociti sono al di fuori del termostato. Si consiglia di praticare molte volte prima di fare esperimenti. Trasferimento di ovociti tra microgocce pur mantenendo lo stesso numero di cellule è un ottimo modo per familiarizzare con questo metodo. La morte cellulare si verifica comunemente durante l&#39;apprendimento microiniezione. Ciò potrebbe verificarsi per una serie di motivi, tra cui l&#39;iniezione di troppo grande di un volume di materiale (cioè l&#39;apertura ago per l&#39;iniezione è troppo grande), colpendo il nucleo con l&#39;ago di iniezione, il piercing sul lato opposto della ovocita o che il materiale iniettato è tossico per l&#39;ovocita. Pratica con l&#39;iniezione di buffer in ovociti fino a quando il tasso di sopravvivenza è almeno del 50% è la chiave per padroneggiare questa tecnica. Se gli ovociti non riescono a maturare, è probabile che il milrinone non è stato diluito abbastanza. Si consiglia il risciacquo degli ovociti attraverso molti grandi gocce di milrinone senza CZB prima maturazione. La ploidia microiniezione seguente analisi è uno dei tanti test per valutare la maturazione meiotica. Altre analisi di routine che usiamo in laboratorio comprendere il controllo della cinetica con cui il progresso ovociti attraverso la meiosi, immunofluorescenza per analizzare la formazione del fuso e l&#39;allineamento dei cromosomi e l&#39;attivazione uovo o la fecondazione in vitro per valutare le conseguenze dello sviluppo della manipolazione dell&#39;ovocita 14,15, 16, 17.

Tabella di reagenti specifici: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Risospendere in DMSO a 2,5 mm </td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Utilizzare solo embrione testato, sterile, filtrata </td></tr><tr><td> CREST autoserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Verde </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-umana Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Laboratori Vector </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina da siero bovino </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Risospendere in DMSO a 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella di attrezzature specifiche: <table border="1"><tbody><tr><th> Nome delle apparecchiature </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> Boccaglio </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> Vetro d&#39;orologio </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Siringa </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 millimetri Petri Dish </td><td> Falco </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur in vetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Lato più caldo </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td></td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Camera di diapositive </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Tubi capillari </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> Microcaps </td></tr><tr><td> Pipetta Puller </td><td> Flaming-Brown micropipetta estrattore </td><td></td><td> Modello P-97 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito </td><td> Nikon </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Micromanipolatori </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modello PLI-100 </td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> CO 2 serbatoi </td><td></td><td></td><td> Per incubatore </td></tr><tr><td> N2 serbatoio </td><td></td><td></td><td> Per la tavola e iniettore </td></tr><tr><td> Antivibranti tavolo </td><td> Produzione tecnico </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Incubatrice </td><td></td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Pipette tenendo </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Microscopio confocale </td><td> Leica </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Strumenti di dissezione </td><td> Strumenti della scienza multa </td><td></td><td> Qualsiasi modello standard </td></tr><tr><td> Camera umidificata </td><td></td><td></td><td> Noi usiamo tupperware </td></tr><tr><td> Coperchio della piastra da 96 pozzetti </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Thomas scientifica </td><td> 6663-F10 </td><td> Lo spessore varia per microscopi particolare </td></tr><tr><td> Centro ben organo piatto cultura </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

microiniezione degli ovociti mouse, maturazione e ploidia valutazione

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Gli errori nella segregazione dei cromosomi portare a cellule aneuploidi. Nelle cellule somatiche, aneuploidia è associata con il cancro, ma in gameti, aneuploidia porta alla sterilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Gameti aploidi forma attraverso la specie-specifici programmi di sviluppo che sono accoppiati a meiosi. La prima divisione meiotica (MI) è unica per meiosi perché cromatidi fratelli restano attaccati mentre cromosomi omologhi sono segregati. Per ragioni non pienamente compreso, questa divisione reductional è incline ad errori ed è più comunemente la fonte di aneuploidia di errori nella meiosi II (MII) o di errori in 1,2 meiosi maschile. Nei mammiferi, l&#39;arresto ovociti in profase di infarto miocardico con un grande vescicola germinale intatto (GV, nucleo) e solo riprendere la meiosi quando ricevono segnali ovulatorio. Una volta riprende la meiosi, MI ovociti completa e sottoposti ad una divisione cellulare asimmetrica, arrestando di nuovo in metafase di MII. Le uova non si completerà MII finché non vengono fecondati dagli spermatozoi. Ovociti possono anche subire la maturazione meiotica utilizzando stabilito in condizioni di coltura in vitro 3. Poiché la generazione di mutanti di topi transgenici e geni-bersaglio è costoso e può richiedere lunghi periodi di tempo, la manipolazione dei gameti femminili in vitro è una strategia più economico e risparmio di tempo. Qui, descriviamo i metodi per isolare profase arrestato ovociti di topo e per la microiniezione. Qualsiasi materiale di scelta possono essere introdotti nel citoplasma dell&#39;ovocita, ma perché meiotically-competente ovociti sono trascrizionalmente silente cRNA 4,5, e non il DNA, deve essere iniettato per gli studi di espressione ectopica. Per valutare la ploidia, descriviamo le nostre condizioni per la maturazione in vitro degli ovociti MII alle uova. Storicamente, cromosoma-tecniche di spandimento sono usati per contare il numero cromosoma 6. Questo metodo è tecnicamente impegnativa ed è limitata solo a identificare hyperploidies. Qui, descriviamo un metodo per determinare ipo-e hyperploidies utilizzando uova intatte 7-8. Questo metodo utilizza monastrol, un inibitore della chinesina-5, che crolla del fuso bipolare in un mandrino monopolare 9 cromosomi separando così in modo che cinetocori individuo può essere prontamente individuato e contati utilizzando un siero anti-CREST autoimmuni. Poiché questo metodo viene eseguito nelle uova intatte, i cromosomi non sono persi a causa di un errore dell&#39;operatore.

Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Gli errori nella segregazione cromosomica portano alla formazione di cellule aneuploidi. Nelle cellule somatiche, l'aneuploidia è associata al cancro, mentre nei gameti l'aneuploidia conduce a...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il grado di polarità degli ovociti in metafase due dopo una manipolazione sperimentale. Iniziare raccogliendo ovociti completamente sviluppati da topi femmine sessualmente mature. Successivamente, microiniettare gli ovociti con il materiale scelto per alterare la proteina di interesse e maturare gli ovociti in vitro fino alla metafase della meiosi due. Poi, stimolare la dispersione dei cromosomi nell'ovocita mediante trattamento con mantro, che determina la formazione di un fuso monopolare.In definitiva, questi risultati possono rappresentare lo stato di ploidia dell'ovocita mediante immunofluorescenza e microscopia confocale. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia della riproduzione e della segregazione cromosomica, come la comprensione dei meccanismi molecolari che portano a un'alterazione della fluidità. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la tecnica di microiniezione è difficile da apprendere, in quanto diversi passaggi sono complessi da descrivere per iscritto. Iniettare intraperitonealmente nei topi femmina sessualmente maturi 5 UI di gonadotropina sierica di topo gravido per massimizzare il numero di follicoli antrali isolati da ciascun animale.Circa 48 ore dopo la somministrazione di PMSG, riscaldare tre millilitri per topo di mezzo di raccolta a 37 gradi Celsius ed equilibrare. Un millilitro di mezzo di coltura per almeno un'ora. Preparare gocce microscopiche di ciascun mezzo in una piastra di Petri e ricoprirle con olio minerale.Ora posizionare la piastra con il mezzo di coltura nell'incubatore e la piastra con il mezzo di raccolta su un riscaldatore per vetrini. Sacrificare il topo, dissezionare le ovaie e posizionarle in un bicchiere da orologio contenente mezzo di raccolta preriscaldato.Utilizzando una siringa per insulina da un millilitro, fissare le ovaie alla piastra e rilasciare i follicoli antrali perforandoli più volte con aghi da 27 gauge fissati insieme. Sotto un microscopio stereoscopico, raccogliere i complessi cumulus-oociti mediante una pipetta di vetro azionata con la bocca. Raccogliere esclusivamente follicoli antrali di grandi dimensioni, evitando i follicoli preantrali più piccoli e gli oociti denudati.Trasferire i complessi in una microgoccia di mezzo di raccolta preparato utilizzando una pipetta piccola leggermente più larga del diametro dell'ovocita. Staccare le cellule del cumulo dai complessi. Trasferire gli ovociti denudati con una pipetta più grande in una microgoccia di mezzo di coltura.Lasciare che gli oociti si riprendano per almeno un'ora nell'incubatrice prima della manipolazione. Preparare le pipette per iniezione tirando tubi capillari in vetro borosilicato con un estrattore meccanico. Rimuovere la camera contenente il mezzo da una lamella con pozzetto singolo.Per creare una piattaforma di microiniezione, posizionare una goccia di cinque microlitri di mezzo di raccolta il più vicino possibile a una goccia di 0,5 microlitri di SIR N-A-C-R-N-A o morfologico per materiale di iniezione di oligonucleotidi, coprire con olio minerale e posizionare sul palchetto del microscopio. Inserire le pipette di iniezione e di ritenzione nei supporti e posizionarle nella goccia di mezzo di raccolta. Accendere le bombole di azoto collegate al pico iniettore e al tavolo antivibrazione.Aprire delicatamente la punta della pipetta di iniezione picchiettandola leggermente contro la pipetta di ritenzione mentre la si riempie con il mezzo. Trasferire da cinque a dieci siti oh dall'incubatore alla goccia di mezzo di raccolta sulla piattaforma. Impostare ora i parametri del pico iniettore su un volume di iniezione compreso tra cinque e dieci picolitri premendo clear.Spostare l'ago di iniezione sulla goccia di materiale e riempirlo. Riportarlo quindi sulla goccia di mezzo. Utilizzare la pipetta di ritenzione per catturare un ovocita e allineare l'ovocita, l'ago di iniezione e la pipetta di ritenzione lungo l'asse x.Con un ingrandimento maggiore, avanzare la pipetta di iniezione attraverso l'ovocita, avendo cura di evitare il nucleo. Una volta perforata la membrana plasmatica, premere "inject"; dopo l'iniezione, ritirare l'ago, rilasciare l'ovocita e ripetere l'operazione. Dopo aver iniettato tutti gli ovociti, riporli nell'incubatrice per mantenerli nel mezzo di coltura per il tempo desiderato, che di solito varia da 12 a 24 ore.Quindi lavare le cellule attraverso diverse gocce di CZB e trasferirle in una microgoccia di CZB sotto olio, incubando per 16 ore per completare la maturazione alla metafase della seconda meiosi. Aggiungere 750 microlitri di CZB contenenti 100 Micromolar Mastri in una pozzetta di una piastra per coltura organotissutale che contenga acqua nell'anello esterno. Lavare ora le uova attraverso diverse gocce di CZB con mastri, quindi trasferirle nella piastra per coltura organotissutale e incubare per un'ora.Fissare le uova in una capsula di Petri contenente paraformaldeide al 2% in PBS per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire le uova nella soluzione di blocco e conservare a quattro gradi Celsius fino all'elaborazione delle uova permeabilizzate per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi eseguire diversi lavaggi con grandi volumi di soluzione di blocco.Eseguire il resto della procedura sul coperchio di una piastra a 96 pozzetti protetta dalla luce in una camera umidificata. A temperatura ambiente, trasferire le uova in gocce da 25 microlitri di soluzione bloccante per 15 minuti. Successivamente, per etichettare i centromeri, trasferire le uova in una goccia di soluzione bloccante contenente Crest Antiserum in una diluizione di uno a 40 e incubare per almeno un'ora.Quindi lavare con tre gocce di soluzione di blocco, incubando 15 minuti in ciascuna. Trasferire le uova in una goccia di soluzione di blocco contenente l'anticorpo coniugato con fluoro quattro e incubare per un'ora. Lavare due volte con soluzione di blocco per rilevare i cromosomi.Incubare in una diluizione 1:5.000 di cytx green e soluzione di blocco, quindi montare i campioni in cinque microlitri di vector shield. Posizionare quattro piccole gocce di vaselina nelle posizioni previste per gli angoli del coprioggetto per evitare lo schiacciamento delle uova. Posizionare il coprioggetto e sigillare con smalto per unghie; conservare in una scatola per vetrini a quattro gradi Celsius fino all'analisi mediante microscopia confocale. Durante l'acquisizione con un obiettivo da 100x, acquisire passi di 0,4 micrometri nel piano Z e immagini dell'intera regione del metafase contando il centromero utilizzando software di acquisizione come Image J del NIH. Le uova di topo euploidi contengono 20 coppie di cinetocori, per un totale di 40 punti in questa proiezione Z di un uovo in metafase II. Il DNA è colorato in verde e i cinetocori K sono colorati in rosso.Le frecce indicano due bracci cromatidici distinti che mostrano un sovrapposizione al cinetocoro numero 17 e al numero 18, a seguito della procedura di microiniezione. Altri metodi, come il Western blotting, la PCR in tempo reale, la valutazione della configurazione del fuso e dell'allineamento dei cromosomi e la fecondazione in vitro, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio in che modo la perturbazione della proteina di interesse influisce sulla maturazione mitotica e sul potenziale di sviluppo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come manipolare i siti specifici e valutare il PLO della metafase due x.

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