Name: Intraluminali occlusione dellarteria cerebrale media (MCAO) Modello per lictus ischemico con la guida flussimetria laser Doppler in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Scopri il modello MCAO per lo studio dell'ictus ischemico nei topi con flussimetria laser Doppler. Questa tecnica intraluminale permette di indurre ischemia controllata e misurare il flusso cerebrale in tempo reale.

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Questo protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università della Florida ed è conforme con il "Principio di prodotti per animali da laboratorio" (NIH pubblicazione n ° 86-23, riveduta 1985). 1. Materiale <ol><li> Animali: maschio topi C57BL / 6 (Laboratori di Harlan, Indianapolis, IN, USA) pesa 20-26 grammi al momento della chirurgia. </li><li> Anestesia: <ol><li> Anestesia macchina: sistema di inalazione VetEquip anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA). </li><li> Inalazione anestetico: isoflurano (Farmaceutica Baxter, Deerfield, IL). </li></ol></li><li> Strumenti chirurgici: SuperCut forbici Iris, diritto (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA); Vännäs micro-forbici, diritto (Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA); Dumont pinze (punta fine, 45 ° punte piegate, strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA), unità di coagulazione bipolare (Essiccatore ad alta frequenza 900, Strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL, USA), clip nave micro (Strumenti di precisione mondiale, Inc., Sarasota, FL, USA) </li><li> Attrezzature chirurgiche: punte sterili di cotone; Panni, spugne garza; sutura (7-0 sutura Seta, Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA); adesivo tissutale (Vetbond, 3M Company, St. Paul, MN, USA); scrub chirurgico : Bethadine, 70% di etanolo, e sterile, soluzione fisiologica allo 0,9%; unguento oculare (Unguento Vet Puralube, Pharmaderm, Melville, NY, USA). </li><li> Occlusione sutura preparazione MCAO: <ol><li> Filamento per la MCA occlusione: 7-0 chirurgica sutura monofilo di nylon (Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA). </li><li> Fonte di calore per ottundimento punta sutura (Unità Cauterio termica, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Gomma siliconica liquida (silicone RTV adesivo, World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA). </li></ol></li><li> Chirurgico / dissezione microscopio (Microscopio stereo Leica MZ6). <ol><li> Illuminatore in fibra ottica (Fiber Optic illuminatore FO1-150, TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA). </li></ol></li><li> Flussimetria laser Doppler (PeriFlux System 5000, Perimed, Stoccolma, Svezia). <ol><li> Flessibile microtip (MT Microtip B500-0 Etero, Perimed, Stoccolma, Svezia) </li></ol></li><li> Temperatura di parametri: <ol><li> Rettale temperature monitor (BAT-12, strumenti di precisione del Mondo, Inc., Sarasota, FL). </li><li> Coperta termica (T / POMPA, TP600, Gaymar, NY, USA). </li></ol></li><li> Colorazione e la misurazione quantitativa di infarto del volume: <ol><li> Soluzione al 2% 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (2% TTC, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). </li><li> I topi cervello matrice affettatrice (Zivic Miller-Lab. Inc., Allison Park, PA, USA). </li><li> Fotocamera digitale (V1253, Kodak Co., Rochester, NY, USA). </li><li> Immagine J software (ImageJ 1.42q software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA). </li></ol></li></ol> 2. Pre-chirurgica passi <ol><li> Prima dell'intervento, i topi sono alloggiati sotto una 12:12 ciclo luce / buio con libero accesso all'acqua e roditori chow. </li><li> Punti di sutura per MCAO sono preparati da ottundimento 1-2mm della punta sutura con il calore e rivestimento 3-4mm dell'albero sutura dalla sua punta in gomma silicone liquido, che permette ad asciugare (7-0, diametro punta, 0,20, 0,25 millimetri, rivestimento lunghezza, 3-4mm, lunghezza sutura 11-13mm). Sterilità devono essere conservati in tutte le fasi di cui sopra. </li><li> Dopo aver soppesato il mouse, l'anestesia viene indotta con il 4% isoflurano in una camera di induzione e mantenuta durante la procedura con 1,5-2% isoflurano nel 30% O 2 e 70% N 2 O miscela di gas tramite una maschera facciale. </li><li> Il mouse è posto in posizione prona su un tampone di garza disteso su una superficie a temperatura controllata operativa (coperta termica), la pelliccia testa rasata. </li><li> Pomata oftalmica lubrificante viene applicato in entrambi gli occhi, e le palpebre sono chiuse per prevenire l'essiccamento occhio durante il processo chirurgico. </li><li> Una linea mediana incisione (1 cm) è effettuata sulla cute sovrastante la calotta cranica dalla linea nucale superiore al nasion e la pelle è tirata lateralmente di apporre un microtip flessibile (MT B500-0 Microtip Etero, diametro 0,5 mm). Il microtip è posto perpendicolarmente alla superficie del cranio parietale destra (1 mm posteriormente e 5 mm lateralmente al bregma) per monitorare il flusso di sangue nel territorio MCA flussimetria laser Doppler. </li><li> Assicurarsi che il microtip flessibile è collegato al cranio saldamente prima che l'animale è rivolto a una posizione supina. Collo dell'animale è posto su un tappetino morbido e il suo naso è tenuto a cono dei sistemi per anestesia. Questo sarà il risultato di avere spazio sufficiente per il microtip flessibile. </li><li> Una sonda di temperatura rettale è inserito per mantenere costante la temperatura interna degli animali di 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Entrambe le zampe anteriori e hindpaws sono nastrate per la superficie di piattaforma operativa, e la coda è registrato al tubo rettale. </li> &lt;/ Ol&gt; 3. MCA occlusione chirurgia: <ol><li> Sotto il microscopio operatorio, una incisione del collo linea mediana è fatto con le forbici tra il manubrio e la mascella sollevando delicatamente la pelle flaccida. </li><li> La coppia ghiandole sottomandibolari sono alla base senza mezzi termini divisi, con la ghiandola sinistra lasciato in situ. La ghiandola sottomandibolare destra è ritratto cranialmente e fissato con il muscolo sternocleidomastoideo. </li><li> La divisione esposto del muscolo omo-ioideo che copre la guaina carotidea è accuratamente diviso con pickup. </li><li> Il diritto arteria carotide comune (CCA) è accuratamente separati e isolati dal nervo vago e la sua guaina (situato lateralmente al CCA). </li><li> D'ora in poi, i 2 metodi chirurgici che sono stati utilizzati di frequente per eseguire MCA occlusione divergono: </li></ol> Koizumi 4 Metodo <ol class="lroman" type="i"><li> Tre punti di sutura collare sciolti (7-0 seta) sono disposte intorno alla destra CCA. </li><li> L'arteria carotide esterna (ECA) è identificato, isolato e cauterizzato (2-3mm distale di biforcazione). Essa può essere successivamente suddiviso con micro-forbici. Per evitare involontari danni periferici nel sito cauterizzazione, la potenza dovrebbe essere impostato a 1 con la manopola di alimentazione. Ciò è coerente per tutti i cauterizzazioni. </li><li> Tensione sufficiente è applicata al collare di sutura più prossimale del CCA per occludere il flusso di sangue (legatura permanente). L'occlusione del flusso sia verificata da un calo ~ 50% dei valori basali perfusione corticale. </li><li> Poi una clip nave si trova appena prima della biforcazione CCA per evitare il flusso retrogrado al momento della arteriotomia. </li><li> Un arteriotomia viene eseguita tra la sutura prossimale legati e la clip sulla nave CCA con micro-forbici (più vicino alla legatura). </li><li> Il calore smussato e siliconato 7-0 sutura in nylon viene introdotto attraverso il arteriotomia e avanzate fino a raggiungere la clip nave. I 2 punti di sutura rimanenti collare sciolti sono delicatamente serrate intorno al CCA tra il arteriotomia e il clip nave per evitare perdite di nuovo il flusso attraverso CCA, con attenzione a non traumatizzare la parete arteriosa, poi la clip nave è ritirata. </li></ol> Longa di 3 Metodo <ol class="lalpha" type="a"><li> L'ECA è identificato, si disgregano per quanto possibile (nei pressi della sua biforcazione nelle arterie linguale e mascellare), cauterizzato (con potenza impostata a 1), e diviso con micro-forbici. </li><li> Due punti di sutura collare sciolti (7-0 seta) sono disposte intorno alla ICA prossimale appena sopra la biforcazione CCA. </li><li> Il CCA è temporaneamente chiuso con una clip nave. L'occlusione del flusso sia verificata da un calo ~ 50% dei valori basali perfusione corticale. </li><li> Poi l'ICA è temporaneamente chiuso con una clip nave al di sopra dei due punti di sutura perdere collare per evitare il flusso retrogrado al momento della arteriotomia. </li><li> Un arteriotomia viene eseguita utilizzando micro-forbici nella vicina Corte dei conti riflette al moncone. </li><li> Il calore smussato e siliconato 7-0 sutura in nylon viene introdotto attraverso il arteriotomia in Corte dei conti e avanzate fino a raggiungere la clip nave applicata in ICA. I 2 punti di sutura collare sciolto in prossimale ICA sono delicatamente serrate intorno al prossimale ICA per evitare il flusso riflusso sanguigno attraverso ICA, con sufficiente attenzione a non traumatizzare la parete arteriosa, poi la clip nave è ritirata. </li></ol> Il resto della procedura è ampiamente convergenti: <ol><li> La sutura occlusione è avanzato lentamente attraverso l'arteria carotide interna (ICA) verso la base cranica fino alla resistenza mite si fa sentire. Una goccia concorrenti in termini di valore del flusso ematico cerebrale in percentuale (= 80%) rispetto al basale è confermato dalla flussimetria laser Doppler. I 2 punti di sutura collare sono stretti attorno al filamento inseriti. </li><li> Per esperimenti di ischemia cerebrale transitoria, la sutura occlusione viene ritirata delicatamente dopo 45 minuti. Questo punto di tempo può essere modificato per vari scopi sperimentali. </li><li> Dopo aver estratto il filo di sutura, il sito arteriotomia è chiuso per evitare di sanguinamento post-operatorio. Nel metodo di Koizumi, si tratta di serraggio in modo sicuro le suture collare intorno al CCA. Nella tecnica Longa, il sito arteriotomia alla base della ECA è cauterizzato, poi i punti di sutura al colletto prossimale ICA sono allentati e rimossi per ripristinare il flusso carotideo. </li><li> Per chiudere l'incisione, la ghiandola sottomandibolare e SCM sono disposti sopra il campo operatorio. I bordi della ferita sono poi approssimato con l'adesivo in tessuto cervicale e nelle aree del cuoio capelluto. In alternativa, una graffetta sutura assorbibile o metallo potrebbe essere usato per chiudere la ferita soprattutto quando sopravvivenza a lungo termine degli animali è destinato. </li><li> Dopo la chiusura incisione, l'animale riceve 1 salina calda ml per via sottocutanea come riempimento del volume. Una dose di analgesici appropriati (cioè Buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg) deve essere utilizzato per minimizzare il dolore dell'animale e il disagio durante il periodo di recupero. L'animal è rimosso dalla sala operatoria e messo in una gabbia di recupero zona calda / per prevenire l'ipotermia, con libero e facile accesso al cibo e di acqua dolce. </li></ol> 4. Post-Op valutazione neurologica Dopo che l'animale riprenda coscienza totale, deficit neurologici possono essere valutati da una scala semplice (scala a cinque punti) come segue 3: <ol start="0"><li> nessun deficit osservabili </li><li> mancata estensione zampa controlaterale (lieve deficit neurologico focale) </li><li> girando in una direzione controlaterale per infarto (moderato deficit neurologici focali) </li><li> cadendo in una direzione controlaterale a infarto (grave deficit neurologici focali) </li><li> depressione del livello di coscienza senza movimento spontaneo </li></ol> 5. Colorazione e la misurazione quantitativa del volume cerebrale infarto <ol><li> Dopo 24 ore di riperfusione MCA, il topo sopravvissuto viene pesato, profondamente anestetizzati con il 4% isoflorane, e sacrificato secondo il protocollo approvato. </li><li> Il cervello è accuratamente rimosso e collocato in una affettatrice cervello di topo matrice, e il cervello intero coronale sezionati a intervalli di 2 mm. </li><li> Le sezioni sono immersi nel 2% TTC in tampone fosfato (PBS) a 37 ° C per 20 minuti. Dopo la colorazione TTC, zona infracted viene mostrato come (non colorate) tessuto bianco adiacente al rosso mattone (vitali) del tessuto (Figura 1). </li><li> Sezioni seriali vengono fotografati con una macchina fotografica digitale e la zona di infarto viene misurata con il programma J immagine. </li><li> L'area di infarto (bianco, senza macchia), la zona dell'emisfero ipsilaterale (bianco e rosso mattone, macchiato), e la zona dell'emisfero controlaterale (rosso mattone, macchiato) sono misurati per ogni sezione. Il volume è calcolato sommando le aree di rappresentanza in tutte le sezioni e moltiplicando per lo spessore della fetta. Dopo aver corretto per l'edema, il volume di infarto è calcolato come segue 9: Volume dell'infarto corretta (CIV),% = [volume nell'emisfero controlaterale - (volume emisfero ipsilaterale - volume dell'infarto)] volume emisfero / controlaterale x 100 </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Dopo l'occlusione e riperfusione del MCA tramite sinistra CCA per stabilire transitoria ischemia cerebrale, gli animali sono sacrificati ed i loro cervelli sezionati coronale sono colorati con TTC per valutare il volume di infarto (Figura 1). <img src="files/ftp_upload/2879/2879fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Sezioni di serie TTC-macchiato cervello coronale (2 mm) di topi sottoposti a MCA occlusione. </ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+on+stroke+prevention%2C+diagnosis%2C+and+therapy.+Report+of+the+WHO+Task+Force+on+Stroke+and+other+Cerebrovascular+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Recommendations on stroke prevention, diagnosis, and therapy. Report of the WHO Task Force on Stroke and other Cerebrovascular Disorders.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 20, 1407-1431 (1989).</li>
<li>Lloyd-Jones, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2009+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2009 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 119, e21-e181 (2009).</li>
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<li>Kapinya, K. J., Prass, K., Dirnagl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+induced+prolonged+protection+against+cerebral+ischemia+in+mice%3A+a+redox+sensitive+mechanism%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Isoflurane induced prolonged protection against cerebral ischemia in mice: a redox sensitive mechanism?</a> Neuroreport. 13, 1431-1435 (2002).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Il modello MCAO è un modello stabilito che replica ischemia cerebrale in specie murina. Questo modello è stato utilizzato nel ratto e successivamente adattato alle topi. Evitare craniectomia per eliminare l&#39;influenza di manipolazione chirurgica sulla permeabilità della barriera emato-encefalica e della pressione intracranica è un vantaggio di questa tecnica. Tuttavia, molte variabili, come il ceppo differenze legate al 10, dimensioni della punta di sutura 11, durata dell&#39;occlusione 6,<...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Maschio C57BL / 6 topi </td><td> Animale </td><td> Laboratori di Harlan, Indianapolis, IN, USA </td><td></td><td> 20-26 gr </td></tr><tr><td> Dissezione microscopio </td><td> Microscopio </td><td> Leica stereo microscopio MZ6 </td><td></td><td> 6.3:1 zoom </td></tr><tr><td> Illuminatore in fibra ottica </td><td> Illuminatore </td><td> TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA </td><td></td><td> FO1-150 </td></tr><tr><td> Isoflurano </td><td> Anestesia </td><td> Farmaceutica Baxter, Deerfield, IL </td><td> 1001936060 </td><td></td></tr><tr><td> SuperCut Iris forbice, diritto </td><td> Strumento chirurgico </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14218 </td><td></td></tr><tr><td> Vännäs micro-forbice, diritto </td><td> Strumento chirurgico </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14003 </td><td></td></tr><tr><td> Pinze punta Dumont multa </td><td> Strumento chirurgico </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 503290 </td><td></td></tr><tr><td> Clip nave </td><td> Strumento chirurgico </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 14120 </td><td></td></tr><tr><td> Essiccatore ad alta frequenza 900 </td><td> Strumento chirurgico </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 500397 </td><td></td></tr><tr><td> 7-0 sutura chirurgica nylon monofilamento </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA </td><td> 1647G </td><td> Sutura per l&#39;occlusione </td></tr><tr><td> 7-0 sutura chirurgica della Seta </td><td> Sutura </td><td> Ethicon, Inc., Somerville, NJ, USA </td><td> 7733G </td><td> Sutura di legatura </td></tr><tr><td> Silicone RTV adesivo </td><td> Gomma siliconica </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 1571 </td><td></td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> Tessuto adesivo </td><td> 3M Company, St. Paul, MN, USA </td><td> 70200746587 </td><td></td></tr><tr><td> Puralube Vet Unguento </td><td> Occhio unguento </td><td> Pharmaderm, Melville, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina hydrochlorode </td><td> Analgesici </td><td> Hospira Inc., Lake Forest, Illinois, USA </td><td> NDC 0409-2012-32 </td><td></td></tr><tr><td> Cauterio unità termica </td><td></td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> 501292 </td><td></td></tr><tr><td> PeriFlux System 5000 </td><td> TCD flussimetria </td><td> Perimed, Stoccolma, Svezia </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BAT-12 </td><td> Termometro rettale </td><td> Mondo Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA </td><td> BAT-12R </td><td></td></tr><tr><td> T / POMPA, TP600 </td><td> Coperta termica </td><td> Gaymar, NY, USA </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA </td><td> T8877 </td><td></td></tr><tr><td> I topi cervello matrice affettatrice </td><td> Cervello affettatrice </td><td> Zivic Miller-Lab. Inc., Allison Park, PA, USA </td><td> BSMAS001-1 </td><td></td></tr></tbody></table>

intraluminali occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (mcao) modello per l&#39;ictus ischemico con la guida flussimetria laser doppler in topi

Intraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAO) Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Mice

L&#39;ictus è la terza causa di morte e la principale causa di disabilità nel mondo, con un costo stimato di quasi 70 miliardi dollari negli Stati Uniti nel 2009 1,2. Il intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) il modello è stato sviluppato da Koizumi 4 nel 1986 per simulare questa patologia di forte impatto umano nel ratto. Una modifica del metodo di MCAO è stato poi presentato dalla Longa 3. Entrambe le tecniche sono stati ampiamente utilizzati per identificare i meccanismi molecolari delle lesioni cerebrali da ictus ischemico e potenziali modalità terapeutiche 5. Questo metodo relativamente non invasivo nei ratti è stata estesa da utilizzare nei topi per sfruttare ceppi transgenici e knockout 6,7. Per modello di ischemia cerebrale focale, una sutura intraluminale è avanzato attraverso l&#39;arteria carotide interna per occludere la base del MCA. Ritraendo la sutura dopo un determinato periodo di tempo imita riperfusione spontanea, ma la sutura può essere mantenuto in permanenza. Questo video sarà dimostrare i due principali approcci per l&#39;esecuzione di intraluminale procedura MCAO nei topi in modo graduale, oltre a fornire spunti per potenziali svantaggi e le insidie. Il tessuto cerebrale ischemico sarà successivamente colorate con 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) per valutare il grado di infarto cerebrale 8.

Il intraluminale occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) modello è il modello più frequente tra i modelli sperimentali utilizzati ictus ischemico. Qui dimostrerà tutto il modello in dettaglio con la guida di flussimetria laser Doppler, ed i suoi risultati rappresentativi.

Intraluminali occlusione dell&#39;arteria cerebrale media (MCAO) Modello per l&#39;ictus ischemico con la guida flussimetria laser Doppler in topi

L'ictus rappresenta la terza causa di morte e la prima causa di disabilità al mondo, con un costo stimato di quasi 70 miliardi di dollari negli Stati Uniti...

In questo articolo video, presentiamo un modello murino di ictus ischemico noto come occlusione dell'arteria cerebrale media o MCAO. Nel metodo originale di occlusione dell'arteria cerebrale media mediante filo, un filo ottuso viene avanzato attraverso l'arteria carotide comune per occludere l'arteria cerebrale media. Questo metodo determina un'occlusione permanente dell'arteria carotide comune.Una modifica metodologica introdotta da Longa permette l'accesso all'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna. Questo metodo preserva la funzione della carotide comune e della sua circolazione distale tra i modelli sperimentali di ictus ischemico. Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media mediante filamento intraluminale in ratti e topi è uno dei modelli più utilizzati; da quando è stato descritto per la prima volta nei ratti, diverse modifiche del modello iniziale sono state pubblicate e attualmente la modifica di Longa rappresenta la variante più importante.Questo modello è meno invasivo e consente di eseguire in modo controllato sia ischemia permanente che transitoria. Il modello di occlusione dell'arteria cerebrale media mediante filamento intraluminale prevede l'inserimento di un monofilamento nell'arteria carotide interna e la sua avanzamento fino a ostruire il flusso sanguigno verso l'arteria cerebrale media. Questo modello produce infarti riproducibili nel territorio dell'arteria cerebrale media e permette la riperfusione dopo il ritiro del filo.La dimensione dell'infarto sembra essere influenzata da molti fattori specifici in questa tecnica, come il diametro del filo, il rivestimento del filo con silicone o poliol lisina, o la lunghezza di inserimento del filamento stesso. In questo video, mostreremo come eseguire questo modello in modo graduale, nonché come evitare molte delle possibili insidie e inconvenienti legati all'uso di questo metodo. Un filo di nylon monofilamento 7.0 verrà utilizzato per l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA).L'estremità del filo di nylon deve essere arrotondata avvicinandola a una fonte di calore. L'estremità arrotondata deve essere dritta e liscia e di lunghezza pari a circa uno o due millimetri. Dopo aver arrotondato l'estremità, il filo deve essere tagliato in modo da ottenere una lunghezza totale di circa 11-13 millimetri.La punta arrotondata del filo viene immersa nel silicone fino a ricoprirne tre-quattro millimetri e lasciata asciugare. Tutti i passaggi di preparazione del filo devono essere eseguiti in condizioni sterili. Dopo aver pesato il topo, l’anestesia viene indotta con il 4% di isoflurano in una camera di induzione.Il topo viene posizionato in posizione prona su un tampone di garza appoggiato su una coperta termica. Per mantenere una temperatura corporea centrale di 37 gradi, l'anestesia viene mantenuta durante l'intero procedimento mediante maschera facciale. La testa rasata viene pulita con alcol, Betadine e nuovamente con alcol.Viene effettuata un'incisione di un centimetro sulla cute per esporre il cranio un millimetro posteriormente e cinque millimetri lateralmente rispetto al bgma. Una sonda flessibile con micro-punta viene fissata perpendicolarmente alla superficie del parietale destro per monitorare il flusso ematico nella regione dell'arteria cerebrale media mediante immagini di flusso Doppler laser.Rimettendo l'animale in posizione supina, si pratica un'incisione mediana del collo con le forbici tra lo sterno e la mandibola. Le ghiandole sottomandibolari appaiate vengono divise in modo ottuso per esporre le strutture sottostanti: il muscolo digastrico, il muscolo sterno-cleido-mastoideo e la trachea. Un triangolo formato da queste strutture e un'ulteriore dissezione mettono in evidenza l'arteria carotide comune, il nervo vago e la vena giugulare interna; l'arteria carotide comune si divide poi nell'arteria carotide esterna e nell'arteria carotide interna.L'arteria occipitale può essere osservata anche a partire dalla regione della biforcazione. Nel metodo COE, l'arteria carotide comune prossimale viene accuratamente separata e isolata dal nervo vago. Vengono predisposte tre suture a collare lasso intorno all'arteria carotide comune.È necessario prestare particolare attenzione affinché il nervo vago non venga incluso nella sutura. L'arteria carotide esterna viene identificata e isolata. Successivamente viene cauterizzata a una distanza di due-tre millimetri dalla biforcazione.La sutura del collare più prossimale sull'arteria carotide comune viene stretta per occludere in modo permanente il flusso ematico. L'occlusione del flusso viene verificata mediante una riduzione dai valori di perfusione corticale basali di circa il 50%. I capi liberi della sutura vengono tagliati. Un clip vascolare viene posizionato subito prima della biforcazione della carotide comune per evitare il flusso ematico retrogrado.Successivamente, si esegue un'arteriotomia tra il morsetto vascolare e la legatura con forbici microchirurgiche. Questo consente di introdurre il filo con estremità arrotondata per effetto del calore nella carotide comune e di avanzarlo fino a raggiungere il morsetto vascolare. Le due rimanenti suture di collare libere vengono quindi legate delicatamente per evitare perdite di reflusso attraverso la carotide comune.La clip sul vaso viene ritirata e il filo ottuso viene delicatamente avanzato nell'arteria carotide interna. Si ottiene una riduzione approssimativa dell'80% rispetto al valore di base quando si avverte una lieve resistenza sul tracciato del Doppler. Le due suture di collegamento vengono quindi strette con sicurezza per evitare sanguinamento retrogrado.Il mouse può ora essere lasciato in uno stato di ischemia per un periodo di tempo appropriato. Per simulare la ripermusione, i punti di occlusione vengono rimossi dopo un intervallo appropriato. Un aumento repentino della lettura del Doppler indica che il flusso sanguigno collaterale è stato ripristinato.Il punto di sutura viene completamente rimosso e le due suture di collegamento vengono completamente strette e tagliate con il metodo lungo. È possibile utilizzare un percorso diverso per occludere l'arteria cerebrale media. Innanzitutto, bisogna identificare, isolare e cauterizzare l'arteria carotide esterna il più distalmente possibile, lasciando una lunghezza sufficiente per l'inserimento della sutura.L'arteria carotide esterna viene quindi divisa e le sue ramificazioni vengono cauterizzate e tagliate anch'esse. Il moncone dell'arteria carotide esterna viene retratto. Preparare due suture di trattenzione allentate intorno all'arteria carotide interna prossimale, appena al di sopra della biforcazione della carotide comune.L'arteria carotide comune viene temporaneamente chiusa con una pinza vascolare. Ciò determina una riduzione dei valori di perfusione di circa il 50% appena a valle della biforcazione. L'arteria carotide interna viene analogamente occlusa con una pinza vascolare ed è eseguita un'arterotomia nelle vicinanze dell'estremità del moncone ritratto della carotide esterna, utilizzando forbici microchirurgiche.La sutura riscaldata e smussata viene introdotta attraverso l'arteria carotide esterna e avanzata fino a raggiungere la clip vascolare sulla carotide interna. Le due suture di legatura libere attorno alla carotide interna prossimale vengono delicatamente strette per evitare il reflusso del flusso sanguigno, senza tuttavia comprimere in modo eccessivo da traumatizzare la parete arteriosa. Successivamente, la clip viene rimossa dall'arteria carotide interna, da cui si dirama l'arteria triptalina.Man mano che la sutura viene avanzata delicatamente, è necessario prestare attenzione per evitare di deviare nuovamente al suo interno. Sul tracciato Doppler si osserva una seconda caduta del segnale. Quando la sutura arrotondata raggiunge l'arteria cerebrale media, le suture del collare devono essere nuovamente strette per prevenire emorragia retrograda.Il mouse può ora essere lasciato in uno stato di ischemia per un periodo di tempo appropriato. Il ritiro del punto smussato ripristina il flusso sanguigno, come indicato dall'aumento sul monitor Doppler. Dopo che i punti sono stati completamente rimossi, il moncone dell'arteria carotide esterna viene cauterizzato.Per prevenire emorragie post-chirurgiche, è necessario prestare attenzione a mantenere la pervietà dell'arteria carotide comune. I punti di chiusura sull'arteria carotide interna prossimale vengono quindi allentati e rimossi, e la pinza sull'arteria carotide comune viene tolta per ripristinare il flusso sanguigno. Ciò è indicato da un secondo picco nella lettura del Doppler.Una volta che il topo riprende conoscenza, i deficit neurologici possono essere valutati in diversi momenti temporali secondo una scala a cinque punti. Un punteggio pari a zero indica l'assenza di deficit neurologici osservabili; un punteggio pari a uno, corrispondente a un ictus lieve, si manifesta con l'incapacità di estendere una quattro PA sul lato opposto all'emisfero colpito dall'ictus. Un punteggio pari a due, corrispondente a un ictus moderato, si manifesta con un movimento di circolazione nella direzione opposta a quella dell'emisfero colpito dall'ictus.Un punteggio pari a tre, corrispondente a un ictus grave, si manifesta con una caduta nella direzione opposta all'emisfero colpito. Un topo con un punteggio pari a quattro non mostrerà alcuna attività motoria spontanea. Per ottenere una misurazione del volume dell'ictus, il cervello viene prelevato dal cranio in un momento appropriato.Dopo la riperfusione, il cervello viene posizionato in un tagliere matrice e l'intero cervello viene sezionato in senso coronale. A intervalli di due millimetri, il cervelletto e i bulbi olfattivi vengono scartati. Ogni sezione di due millimetri viene immersa in soluzione di TTC al 2% per 20 minuti a 37 gradi al buio.Le immagini digitali delle sezioni cerebrali mostrano che il tessuto vivo colorato con il TTC appare rosso, mentre il tessuto infartuato rimane bianco pallido in ciascuna sezione. L'area dell'infarto, indicata qui come uno, l'area dell'intero emisfero ipsilaterale indicata qui come due e l'area dell'emisfero controlaterale indicata qui come tre vengono misurate tutte mediante il programma Image J. Dopo aver misurato le aree per tutte le sezioni, i volumi possono essere calcolati sommando i valori delle aree e moltiplicando per lo spessore della sezione.Per calcolare il volume dell'infarto corretto per l'edema, si utilizza la seguente formula. Questo volume viene espresso come percentuale del volume emisferico ipsilaterale. Il modello MCO fornisce risultati riproducibili.Tuttavia, alcuni fattori procedurali possono interferire con l'esecuzione della tecnica. Il rivestimento in silicone all'estremità del filo di sutura è importante perché rende più liscia la superficie del filo e riduce il rischio di abrasione endoteliale o di perforazione vascolare. Inoltre, il rivestimento del filo può essere modificato per rispondere a diversi obiettivi sperimentali.Un rivestimento che si estende oltre tre o quattro millimetri dalla punta ostruirebbe l'arteria a monte dell'arteria cerebrale media, aumentando il volume totale dell'ictus. I punti di sutura colorati devono essere applicati con attenzione per non comprimere il nervo vago e devono essere annodati delicatamente in modo da non traumatizzare la parete AAL. La temperatura corporea del topo può influenzare l'estensione dell'infarto, pertanto deve essere mantenuta stabile per tutta la durata della procedura.Speriamo che la visione di questo video ti aiuti a orientarti nel processo chirurgico e fornisca un punto di partenza solido per i tuoi esperimenti. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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