Name: Induzione e test di ipossia in coltura cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Impara a indurre e valutare l'ipossia in colture cellulari utilizzando cloruro di cobalto e camere ipossiche. Questo protocollo permette di misurare l'espressione di HIF-1 alpha tramite western blot e rilevamento della luminescenza.

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1. Ipossia indotta da CoCl 2 soluzione Cobalto (II) cloruro esaidrato (CoCl 2 • 6H 2 O, PM = 237,9) è un induttore chimico di ipossia-inducibile fattore-1.3 8. Questo prodotto è solubile in acqua (100 mg / ml), ottenendo una soluzione limpida e rosso. <ol><li> Preparare una soluzione 25mM stock in acqua sterile dd (preparare immediatamente prima dell'uso) </li><li> Usa CoCl 2 alla concentrazione finale di 100μM nei vostri mezzi normali di coltura cellulare per indurre ipossia. </li><li> Aggiungere il CoCl 2 supporti contenenti alle vostre cellule e incubare le culture per 24 ore in un convenzionale incubatore (37 ° C, 5% 2 C0). </li></ol> La concentrazione di sopra lavori per le linee cellulari che abbiamo testato, ma ogni linea cellulare deve essere testato a diverse concentrazioni (per stabilire una curva dose-dipendente), così come in tempi di incubazione diversi al fine di limitare la tossicità legata alla droga ed ottimizzare il dosaggio. 2. L'ipossia indotta a modulare Incubator Camera <ol><li> Preparare almeno due colture di cellule identiche (cultura gemello). Le colture cellulari possono essere in fusti, piatti o piatti della cultura. Per aprire la camera, per prima cosa aprire i due fascette di plastica bianca situato sul tubo attaccato alla camera (tubi utilizzati per l'iniezione / eliminazione dei gas ipossia) e delicatamente aprire il morsetto ad anello in acciaio. </li><li> Rilasciare il morsetto. Il coperchio e vassoi possono essere rimossi. </li><li> Posizionare la coltura cellulare nella camera di ipossia. Anche mettere una piastra di Petri contenente acqua sterile nella camera di fornire un'adeguata umidificazione delle culture. </li><li> Luogo della cultura "gemello" cella in normossia come controllo. </li><li> Assicurati che il tuo vassoi sono garantiti e non in movimento, e quindi chiudere la camera con il suo coperchio. Posizionare correttamente il morsetto anello in acciaio per garantire la chiusura ermetica della camera e chiuderlo. </li><li> Per creare l'ipossia, collegare il tubo di un "serbatoio di ipossia" contenente un 1% O 2 miscela di gas. Se avete un misuratore di portata collegato al vostro serbatoio da camera saranno direttamente collegati ad esso (gas serbatoio-flow metri da camera). Usiamo un misuratore di portata incorporato nel nostro regolatore. </li><li> E 'importante rimuovere la maggior parte se non tutte ossigeno presente nella camera e nei vostri mezzi, per farlo lavare la camera aprendo il serbatoio del gas ad una portata di 20 litri al minuti per 7-10 minuti, poi spegnere rapidamente il il flusso del gas e chiudere completamente la camera chiudendo entrambe le fascette bianche. </li><li> Ritorna la camera ad una convenzionale incubatore per il periodo di tempo desiderato. Se si utilizzano grandi culture, consentire ai media nelle culture di de-gas per 1 - 2 ore e poi ripetere a filo. I passi sopra si basano sulle raccomandazioni costruttore '(Billups-Rothenberg, Inc). Assicurati di serbatoio del gas siano garantiti a tutti i tempi. </li></ol> Note: <ul><li> Al fine di eliminare l'O 2 contenute nei media è consigliato a ri-gas nella camera di una volta dopo 1-3 ore. </li><li> Per il tempo di incubazione più lungo di 48 ore è anche consigliato di re-gas della camera. </li><li> Sensori di ossigeno (elettrodi / manometro) che consentono misurazioni della O 2 contenuto in cellule / camera fornirà una misurazione più precisa del intracellulare / camera di O 2 contiene). </li><li> Cellule in coltura di varie lunghezze di tempo per fare una curva a tempo aiuterebbe determinare l'espressione ottimale tempo di HIF-1α nelle vostre cellule particolare. </li></ul> 3. Valutazione di ipossia <ol><li> HIF-1 α rilevamento mediante western blot. <ol><li> Riaprire la tua camera come descritto nella sezione 2.2 e immediatamente inserire il vostro culture sul ghiaccio. </li><li> Lyse ipossia cellule trattate e non trattate con soluzione al 5% SDS nelle piastre quindi trasferire il lyzate cellula ai tubi, ultrasuoni, spindown i detriti cellulari e raccogliere il surnatante. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​con BCA kit, preparare campione con l'aggiunta di tampone di caricamento e il riscaldamento a 95 ° C per 5 min. </li><li> Elettroforesi delle proteine ​​su un 8% SDS-poliacrilammide gel e il trasferimento alle membrane di nitrocellulosa. </li><li> Bloccare la membrana in PBS contenente 5% senza grassi del latte secco e lo 0,1% di Tween 20 a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C durante la notte su agitatore. </li><li> Durante la notte con anti-HIF-1α anticorpo primario monoclonale (1 / 600) nel buffer stesso immunoblot a 4 ° C. </li><li> Lavare 3 volte in PBS contenente 0,1% di Tween 20 a temperatura ambiente, 5 minuti ogni volta e incubare con anticorpi secondari HRP-(1 / 2000) in PBS + 0,1% Tween 20 per 45 min. </li><li> Lavare 3 volte in PBS contenente 0,1% di Tween 20 a temperatura ambiente, 5 min / ora. </li><li> Usa Pierce ECL kit e X-ray film per mostrare la band proteina </li></ol></li><li> L'ipossia Responsive Element (HRE). HIF-1α regola numerosi geni (cioè VEGF, EPO) legandosi a una sequenza denominata ipossia elemento regolatore (HRE). Utilizzando HRE associati a un gene marcatore it è possibile rilevare l'attività HIF 9. Per utilizzare questo metodo, in primo luogo è necessario trasfezione le cellule con un plasmide HRE-luciferasi utilizzando un metodo di trasfezione adattato alle vostre cellule. Per esempio abbiamo usato Lipofectamine 2000. Celle devono essere transfettate almeno 4 ore prima di essere incubate in ipossia e normossia. Questa volta permette al DNA di penetrare nelle cellule in modo che questo primo passo non è influenzata dall'ipossia. Il segnale luciferasi viene rilevato utilizzando un kit di luciferasi Assay. <ol><li> Incubare il tuo HRE transfettate cellule in ipossia in camera di modulare o utilizzare HRE transfettate cellule incubate con CoCl 2, includere un controllo normossia. </li><li> Dopo il periodo di incubazione desiderato, togliere terreno di crescita dalle cellule. </li><li> Lavare le cellule in PBS, rimuovere la PBS. </li><li> Dispensare 400μl reagente 1X lisi nel piatto cultura e raschiare le cellule attaccato, poi trasferirli in una provetta da micro. </li><li> Detriti pellet per centrifugazione breve. </li><li> 20μl mix di lisati cellulari surnatante con 100μl di Reagente saggio luciferasi e misurare la luminescenza con un luminometro. </li></ol></li></ol> 4. Rappresentante dei risultati: In cellule K562 (linea cellulare di leucemia umana) in coltura 2 giorni in ossigeno, rispetto al normossia, ipossia induce un aumento di HIF-1α proteina che è stato rilevato dal western blot (Figura 1). Utilizzando HRE-luciferasi modificato 293 cellule (embrionali linea cellulare di rene) coltivate in ipossia, un significativo aumento di HIF-1α attività è stata rilevata nelle cellule ipossiche (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: Aumento HIF-1α nelle cellule ipossiche. K562 cellule sono state cultura in normossia e ipossia (camera di ipossia) per 48 ore e analizzati mediante western blot utilizzando un anticorpo specifico per HIF-1α. Un anticorpo specifico per l'actina è stata utilizzata per il controllo di carico. <img src="/files/ftp_upload/2899/2899fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: HIF-1α attività. HRE-luciferasi modificato 293 cellule sono state coltivate in ipossia e normossia per 48 ore e poi lisati di rilevare il segnale luciferasi utilizzando un kit luciferasi saggio e un luminometro. I risultati sono espressi come unità di luminescenza relativa (RLU).

<ol><li>Swinson, D. E., O'Byrne, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+hypoxia+and+epidermal+growth+factor+receptor+in+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interactions between hypoxia and epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung cancer.</a> Clin Lung Cancer. 7, 250-256 (2006).</li>
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<li>Emerling, B. M., Weinberg, F., Liu, J. L., Mak, T. W., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+regulates+p300-dependent+hypoxia-inducible+factor+1+transcriptional+activity+through+Forkhead+transcription+factor+3a+%28FOXO3a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN regulates p300-dependent hypoxia-inducible factor 1 transcriptional activity through Forkhead transcription factor 3a (FOXO3a).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 2622-2627 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Proliferazione cellulare e vitalità in condizioni di ipossia variano molto a seconda dei tipi di cellule. Pertanto, si dovrebbe regolare il numero di cellulare o il numero di piatti culture si parte con per assicurarsi che si avrà abbastanza cellule / proteine ​​per i vostri esperimenti. Il metodo di cloruro di cobalto ha il vantaggio di essere poco costoso e veloce. Questo prodotto imita ipossia inducendo HIF-1/3α ma può anche regolare altri geni, assicurarsi che questo prodotto sia adatto al vostro progetto, controllando quali altri effetti potrebbe avere sulla funzione e il fenotipo delle cellule particolari indipendentemente dal &quot;mimare- ipossia &quot;effetto. Un altro farmaco usato anche per simulare l&#39;ipossia è deferoxamina mesilato (deferoxamina, impiegato a 100 concentrazione mM finale). L&#39;uso di questi farmaci consente al sperimentatore di aprire la piastra di coltura / piatto / fiasco molte volte senza compromettere la &quot;condizione di ipossia&quot;. Il livello di ossigeno contenuto nella miscela di gas può variare a seconda della esperimenti e tipi di cellule come valori ipossia variano a seconda dei tessuti e tipi cellulari. Infatti, alcune cellule ipossiche sono nel 5% O 2 bisogno di altri meno dell&#39;1% O 2 da ipossia. 5% di CO 2 è aggiunto alla miscela di gas per stabilizzare il pH delle culture, il resto del gas è di solito azoto. Camere ipossiche hanno il vantaggio di non utilizzare farmaci che possono alternare il comportamento delle cellule indipendentemente dalla tensione di ossigeno. Tuttavia, non tutti i tipi di sperimentazione può essere fatto come l&#39;ossigeno rientra nella camera ad ogni apertura e diminuisce così l&#39;ipossia. Si dovrebbe prendere in considerazione questo fattore nel vostro esperimenti; ipossia / riossigenazione è una specifica condizione che può colpire alcuni tipi di cellule. Un&#39;alternativa è quella di utilizzare postazioni ipossia (collegato al premiscelati serbatoi di gas o per sistemi di miscelazione dei gas) o più grande incubatore ipossia (camera di processo ipossia con vano portaoggetti) che permette la sperimentazione di cambiare i media e manipolare le cellule in continuo ambiente ipossico. Varie camere di ipossia sono stati commercializzati negli ultimi dieci anni e deve essere scelto in base al tuo laboratorio utilizzati, progetti, spazio, dimensione e budget. Sempre garantire il buon uso e la condizione della vostra camera per garantire condizioni di coltura corretto. In generale quando si utilizza una camera, il livello di ipossia può essere modulata scegliendo il mix di gas vari (es. 1%, 5% al ​​10% di ossigeno). Per quanto riguarda la rilevazione di HIF-1α, è importante sapere che alcune linee cellulari tumorali esprimere HIF-1α in normossia. E &#39;quindi fondamentale utilizzare un normossia-controllo per determinare il livello basale di HIF in queste linee cellulari. HIF-1α può anche essere presente in normossia non-maligne delle cellule in seguito alla stimolazione delle cellule o stress. Questo potrebbe verificarsi anche se queste cellule sono affamate, assicurarsi che il proprio colture di cellule di alimentazione siano correttamente e mantenuto.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Anti-HIF-1α </td><td> Invitrogen </td><td> 458400 </td></tr><tr><td> Cobalto (II) cloruro </td><td> Sigma </td><td> C8661-25G </td></tr><tr><td> Incubatore Camera </td><td> Billups-Rothenberg </td><td> MIC-101 </td></tr><tr><td> HRE-luciferasi plasmide </td><td> Adgene </td><td> Plasmide 26731 </td></tr></tbody></table>

induzione e test di ipossia in coltura cellulare

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

L&#39;ipossia viene definita come la riduzione o la mancanza di ossigeno a organi, tessuti o cellule. Questa diminuzione di tensione di ossigeno può essere dovuta ad un apporto ridotto di ossigeno (cause includono insufficiente rete di vasi sanguigni, difettoso dei vasi sanguigni, e anemia) o ad un aumento del consumo di ossigeno rispetto alla fornitura (causata da un tasso di improvvisa proliferazione di cellule superiore) . L&#39;ipossia può essere fisiologico o patologico, come nei tumori solidi 1-3, artrite reumatoide, aterosclerosi, ecc ... Ogni tessuti e cellule hanno una diversa capacità di adattarsi a questa nuova condizione. Durante l&#39;ipossia, l&#39;ipossia inducible factor alpha (HIF) è stabilizzata e regolamenta vari geni come quelli coinvolti nell&#39;angiogenesi o il trasporto di ossigeno 4. La stabilizzazione di questa proteina è una caratteristica di ipossia, quindi il rilevamento HIF è utilizzato di routine per lo screening per 5-7 ipossia. In questo articolo proponiamo due semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari di mammifero e semplici test per valutare lo stato di queste cellule ipossiche.

Qui vi proponiamo semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari e semplici test per valutare lo stato di ipossia delle culture.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

L'ipossia è definita come la riduzione o l'assenza di ossigeno negli organi, nei tessuti o nelle cellule. Questa diminuzione della tensione di ossigeno può essere dovuta a un ridotto apporto in...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre l'ipossia in colture cellulari. Questo viene ottenuto coltivando prima le cellule in presenza di un inibitore chimico del fattore inducibile uno ipossia oppure coltivando le cellule in un incubatore o camera ipossica riempiti con una miscela gassosa speciale. Successivamente, l'ipossia viene rilevata verificando il livello di espressione della proteina HIF-1α negli estratti proteici cellulari oppure misurandone l'attività mediante un vettore ENC codificante per sequenze di legame per HIF-1α.In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano un aumento dei livelli di espressione e dell'attività di HIF one alpha mediante blotting western e rilevamento della luminescenza. Mi chiamo Danny U. Sono un ricercatore nel laboratorio di Patrizia Inda. Oggi illustrerò questa procedura per indurre l'ipossia con cloruro di cobalto.Iniziare preparando una soluzione madre di cloruro di cobalto 25 millimolare in acqua distillata sterile. Aggiungere la soluzione alle cellule e coltivare a una concentrazione finale di 100 µM. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% di CO₂ per indurre l'ipossia.Utilizzando una camera d'incubazione modulare, preparare almeno due colture cellulari identiche. Tuttavia, si consiglia di eseguire un'analisi in triplicato per ogni condizione. Aprire la camera d'incubazione modulare aprendo innanzitutto le due clip di plastica bianche posizionate sui tubi collegati alla camera, quindi rimuovere il coperchio e i vassoi.Posizionare la coltura cellulare nella camera ipossica con una piastra di Petri contenente acqua sterile all'interno della camera per garantire un'adeguata umidificazione delle colture. Posizionare la seconda coltura cellulare in condizioni di normossia come controllo per indurre l'ipossia. Collegare il tubo a un serbatoio per ipossia contenente una miscela gassosa al 1% di ossigeno.Se un flussimetro è collegato al serbatoio, la camera sarà collegata direttamente ad esso. Utilizziamo un flussimetro incorporato nel regolatore per rimuovere tutto l'ossigeno presente nella camera e nel mezzo. Sfiatare la camera aprendo il serbatoio del gas a una portata di 20 litri al minuto per quattro o sette minuti.Quindi spegnere rapidamente il flusso di gas e chiudere completamente la camera, serrando entrambe le pinze bianche. Riposizionare la camera in un incubatore convenzionale per il periodo di tempo desiderato.Se si utilizzano colture grandi, lasciare il mezzo e le colture nelle DGAs per uno o due ore, quindi ripetere il risciacquo per valutare l'ipossia. Utilizzando la rilevazione di HIF-1α mediante western blot, riaprire la camera come dimostrato in precedenza e posizionare immediatamente le colture sul ghiaccio. Lisare le cellule trattate e non trattate con ipossia con soluzione al 5% di SDS.Quindi trasferire i lisati in provette e sottoporli a sonica per estrarre le proteine, centrifugare per far sedimentare i detriti cellulari e raccogliere il surnatante. Successivamente, misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit BCA. Poi preparare un campione per gel aggiungendo il buffer di caricamento e riscaldando a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Separare le proteine su un gel di poliacrilammide SDS all'8% e trasferirle su una membrana di nitrocellulosa. Bloccare la membrana in PBS contenente latte in polvere scremato al 5% e tween 20 allo 0,1% per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius su un agitatore. Incubare la membrana durante la notte con un anticorpo monoclonale primario anti HIF one alpha nello stesso tampone a quattro gradi Celsius.Il giorno successivo, lavare la membrana tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS contenente 0,1% di tween 20 a temperatura ambiente, quindi incubare con un anticorpo secondario coniugato con HRP in PBS aggiunto di 0,1% di tween 20 per 45 minuti. Lavare nuovamente tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS contenente 0,1% di tween 20 a temperatura ambiente.Quindi incubare la membrana in soluzioni di rilevamento chemiluminescenti ed esporla a pellicola radiografica per misurare l'attività della luciferasi. Rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule in coltura. Lavare le cellule in PBS.Quindi aggiungere 400 microlitri di reagente di lisi 1x nella piastra di coltura. Raschiare le cellule aderenti e trasferirle in una provetta microcentrifuga. Pellettare i detriti mediante una breve centrifugazione.Mescolare 20 microlitri di surnatante del lisato cellulare con cento microlitri di reagente per il saggio della luciferasi e misurare la luminescenza utilizzando un luminometro. Le cellule K 5 62 sono state coltivate in condizioni di normossia o ipossia per 48 ore e analizzate mediante western blot utilizzando un anticorpo specifico per H one alpha. Un anticorpo specifico per beta actina è stato utilizzato come controllo di caricamento.I risultati mostrano un aumento di HIF-1α nelle cellule ipossiche. Le cellule 293 modificate con luciferasi HRE sono state coltivate in condizioni di ipossia o normossia per 48 ore, quindi lisate per rilevare il segnale di luciferasi mediante un kit per saggio della luciferasi e un luminometro. È stato inoltre rilevato un aumento dell'attività di HIF-1α nelle cellule ipossiche.I risultati sono espressi come luminescenza relativa. Unità Non dimenticare che lavorare con gas sotto pressione può essere estremamente pericoloso e precauzioni come fissare correttamente la bombola di ossigeno al muro o al banco, aprire e chiudere in modo appropriato la bombola di ossigeno, nonché controllare la pressione, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

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