Modellistica neurale segnalazione immunitario di emicrania episodica e cronica utilizzo Depressione Diffusione In Vitro

L'obiettivo di questo video è illustrare come le colture di fette di ippocampo possano essere utilizzate per decifrare la segnalazione immunitaria neurale che modula la suscettibilità alla diffusione della depressione, la causa più probabile alla base dell'aura emicranica e forse dell'emicrania. La diffusione della depressione è facilmente evocabile nelle colture di fette di ippocampo. Poiché le colture vengono mantenute in vitro per settimane, il comportamento dei singoli tipi di cellule può essere misurato, imitato e modulato per periodi prolungati.

Ciò è particolarmente importante per lo studio della segnalazione immunitaria neurale. Poiché le fette di cervello dell'ippocampo maturo raggiungono uno stato immunitario quiescente, le risposte immunitarie della depressione diffusa possono essere valutate senza gli effetti potenzialmente confondenti dell'anestesia utilizzando moderne tecniche di biologia molecolare. Di conseguenza, è possibile determinare il rilevamento sensibile delle citochine che segnalano da un minimo di 50 cellule a circa 90.000 cellule in una fetta.

Le colture di fette di cervello ippocampale sono ideali per l'uso nello sviluppo di nuove terapie immunitarie neurali per alleviare l'emicrania. Mi chiamo Yian Berg e sono Aya Puss e Heidi Mitchell del laboratorio di Richard Craig e del Dipartimento di Neurologia dell'Università di Chicago Medical Center. Oggi dimostreremo l'uso dell'ippocampo di ratto, dei pidocchi, delle colture e lo studio della segnalazione immunitaria di basso livello della diffusione della depressione.

La diffusione della depressione è un evento neurale parossistico che viene innescato da un'esplosione di aumento dell'attività sinaptica che viene poi rapidamente seguita da una perdita transitoria di tutta l'attività. Prove crescenti mostrano che la segnalazione immunitaria di basso livello può influenzare e a sua volta essere influenzata dall'attività sinaptica all'interno del cervello. Ipotizziamo che le citochine modulino la suscettibilità alla diffusione della depressione e, di conseguenza, l'aura emicranica e forse anche l'emicrania.

Le procedure che descriviamo qui sono progettate per ridurre al minimo l'attivazione delle cellule immunitarie potenzialmente confondenti e aumentare la nostra capacità di rilevare la segnalazione immunitaria di basso livello. Questo ci consente di rilevare la più ampia gamma di segnali immunitari neurali e le sue interazioni con la diffusione della depressione. Per iniziare questa procedura, realizzare elettrodi rettificati tagliando tubi di vetro a lunghezze di 4,5 millimetri.

Quindi lucidare brevemente a fuoco le sezioni tagliate su entrambe le estremità. Quindi, portare a ebollizione 100 millilitri di cloruro di potassio molare, aggiungere 3,5 grammi di agar e 0,5 grammi di EDTA. Mescolare continuamente la miscela per produrre una soluzione di colore giallo chiaro.

Montare un pezzo di tubo flessibile corto su ciascun tubo di vetro. Quindi aspirare la soluzione calda di cloruro di potassio agri nel tubo di vetro e a breve distanza nel tubo flessibile. Rilasciare l'aspirazione e lasciare che l'agar di cloruro di potassio goccioli lentamente dalla punta aperta del tubo di vetro.

Mentre l'agar gocciola, tocca un pezzo di ghiaccio con la punta del tubo di vetro aperto, che spingerà l'agar a gelificare sulla punta dell'elettrodo e non a gelificare dopo essersi ritirato nel tubo di vetro. Una volta che l'agar è stato frullato, rimuovere delicatamente il tubo flessibile senza alterare la posizione dell'agra. Nelle provette di vetro, mettere 0,5 millilitri di cloruro di potassio molare in ciascun pozzetto di un rack per provette da centrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi posizionare la punta di ciascun tubo di vetro di cloruro di potassio in pozzetti individuali per mantenere le punte umide. Quindi, tieni un filo d'argento calibro 15 lungo 80 centimetri con un emostato. Pulisci ciascuno dei quattro lati raschiando il filo attraverso una smerigliatrice fissata al piano di lavoro.

Successivamente, taglia il filo in lunghezze di quattro centimetri. Metterli in una fiala di scintillazione riempita di candeggina per 20-30 minuti. Per posizionare uno strato solido di argento su cloruro d'argento sulla superficie d'argento pulita, piegare il filo a metà e inserirlo nel tubo di vetro riempito con agar cloruro di potassio lasciando circa quattro o sei millimetri esposti.

Quindi rivestire la punta del tubo di vetro contenente il filo d'argento e una piccola parte del filo con appiccicoso, una colla resistente all'acqua e flessibile per evitare che l'agar di cloruro di potassio si secchi, ripetere per tutti gli elettrodi e lasciare asciugare la colla durante la notte. Dopo il prelievo, conservare gli elettrodi in fiale di scintillazione con cinque millilitri di cloruro di potassio molare e 25 milligrammi di EDTA. Circa cinque o sei elettrodi per fiala a quattro gradi Celsius.

Realizzare elettrodi di registrazione con tubi di vetro silicato bo con filamenti. Quindi, crea un elettrodo stimolante tagliando una lunghezza di circa 20 centimetri di meridio di platino rivestito in teflon. Quindi piega la lunghezza a metà, lega le estremità libere in un nodo quadrato sciolto, lasciando circa due centimetri dal nodo alle estremità del filo.

Fissare il nodo nel mandrino di un trapano elettrico posto su un tavolo tenendo l'altra estremità del filo con un emostato. Accendere e spegnere brevemente il trapano finché il filo non è ben attorcigliato. Per collegare i fili intrecciati in platino meridio ai fili conduttori, prima fissare con nastro adesivo il filo intrecciato in platino meridio su un piano di lavoro e far cadere una pozzanghera di acido cloridrico concentrato su un'estremità libera del filo intrecciato.

Quindi posizionare l'estremità spelata su un filo conduttore adiacente all'estremità del filo attorcigliato e applicare il calore da un saldatore a punta fine, quindi saldare fino a quando i due fili non sono saldamente attaccati. Infilare un breve tratto di guaina termorestringente sulla connessione del cavo esposto e restringerlo con fuoco termico. Lucidare la punta di una pipetta da 15 centimetri e guidare il filo meridiano di platino attorcigliato lungo la pipetta.

Utilizzare una resina epossidica idrorepellente per sigillare entrambe le estremità dell'elettrodo. Infine, collegare le spine a banana alle estremità del cavo per il collegamento all'isolatore di stimolo sotto osservazione stereoscopica. Posizionare la punta dell'elettrodo nel PBS e cercare le bolle prodotte elettroliticamente provenienti solo dall'estremità tagliata delle punte degli elettrodi, se eventuali bolle provengono dai lati dei fili attorcigliati.

Tagliare l'elettrodo trasversalmente utilizzando una lama di rasoio a filo singolo per ristabilire l'isolamento intatto agli assi lunghi dei fili. Quando si risolvono i problemi per risolvere gli effetti dello stimolo aberrante, provare a creare una punta dell'elettrodo appena tagliata. Un altro passaggio importante è la preparazione dei piatti di registrazione, che consistono in un inserto di coltura a fette e un piatto di coltura da 35 millimetri che si trova su due barre di vetro da 1,0 x 12 millimetri distanziate di circa 1,0 centimetri l'una dall'altra.

Le aste di vetro vengono fissate alla base del piatto riscaldando i tubi di vetro e quindi premendoli nella base con una pinza. Per le condizioni di registrazione statica, aggiungere 1,5 millilitri di supporto al piatto. Successivamente, immergere un pezzo di cotone sterile largo 10 millimetri e lungo da tre a quattro centimetri.

In 1,0 millilitri di supporto, piegare il cotone a metà lungo l'asse lungo e posizionarlo lungo la parete interna dell'inserto. Con una pinza sterile, il cotone bagnato aiuta a mantenere l'umidità del piatto. Tre pezzi di tubo comprimibili lunghi quattro millimetri sono equidistanti attorno all'inserto.

Coprire bene il piatto con una pellicola di cloruro di polivinile per consentire lo scambio di gas. Quindi tagliare intorno alla sua parete verticale centrale con una lama di rasoio a filo singolo per rimuovere l'eccesso di cloruro di polivinile. La pellicola evoca circa tre potenziali di campo con impulsi di 100 microsecondi a 0,2 hertz, iniziando con una corrente di circa 1-5 microampere che è sufficiente per innescare una risposta.

Spostare l'elettrodo di registrazione in incrementi lungo l'asse lungo del neurone parametallico fino a quando il potenziale di campo è massimo. Quindi, aumentare la corrente con un elettrodo di registrazione in questa posizione e notare la risposta massima della corrente di circa 10-20 micro ampere. Infine, utilizzare la metà dell'intensità massima dello stimolo per gli esperimenti per determinare la soglia per la depressione diffusa evocata sinapticamente

Cambia il paradigma di stimolazione per evocare manualmente singole raffiche di 100 microsecondi per impulso a 10 hertz. Aumentare progressivamente l'intensità di corrente per raffica di stimolo fino a quando non si innesca la depressione diffusa. Rapporto diffusione della soglia di depressione nei lumi innescare la diffusione della depressione ogni nove minuti per un'ora.

Registra circa tre aree di potenziale veloce e lento variazioni di potenziale tramite sistemi di elaborazione del segnale digitale separati. Dopo l'ultima depressione diffusa, riportare l'inserto di coltura alle normali condizioni di incubazione e segnare il coperchio del piatto di coltura. Per notare la cultura che ha sperimentato la diffusione della depressione, cambiare i media ogni tre o quattro giorni fino al raccolto della coltura.

Iniziare questa procedura diluendo la selectina ISO a 20 microgrammi per millilitro in terreni di coltura. Quindi, incubare le colture di fette in condizioni di incubazione normali, da quattro a 10 ore prima dell'imaging, accendere la fotocamera del microscopio, la luce UV, il controllo della temperatura e i gas almeno un'ora prima dell'imaging. Quindi, impostare il software metamorph per l'imaging, posizionando l'inserto in un piatto di coltura da 35 millimetri con due barre di vetro da un millimetro sul fondo.

Quindi inserire tre pezzi di tubo di gomma da due millimetri tra le pareti dell'inserto e la capsula di coltura. Per stabilizzare ulteriormente l'inserto, posizionare un pezzo di cotone largo 10 millimetri imbevuto di un ulteriore millilitro di supporto all'interno dell'inserto. Per mantenere un ambiente umidificato, coprire bene la parte superiore del piatto di coltura con una pellicola di cloruro di polivinile.

Per prevenire la perdita di liquidi, assicurarsi che l'obiettivo dell'imaging sia lo strato di tre cellule parametalliche CA. Notare l'orientamento delle fette scattando foto di fase a cinque x 10 x e 20 x nella finestra di messa a fuoco fine, impostare l'intervallo corrente su otto e la precisione su un clic, trovare la messa a fuoco per garantire un'immagine a fuoco nella finestra time-lapse di acquisizione. Selezionare l'intervallo di tempo in un minuto e la durata in sei ore per catturare con precisione i movimenti microgliali.

L'imaging non dovrebbe essere meno frequente di una volta al minuto alla fine del film. Verificare la presenza di lesioni cellulari mediante lo screening CY talk per esperimenti PCR. Immergere successivamente gli inserti di coltura a fette in due o tre millilitri di RNA e conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di tre giorni fino a un'ulteriore elaborazione.

Per raccogliere, rimuovere il tessuto estraneo usando un coltello di vetro, mettere le fette in singoli RNA. Provette da centrifuga da 1,5 millilitri prive di DNA contenenti 0,5 millilitri di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato. Utilizzando un pennello a punta fine spinare i campioni, i 10, 000 giri/min per un minuto in modo stereotipato in modo che tutte le fette aderiscano allo stesso lato dei loro tubi.

Rimuovere il surnatante PBS e risospendere il campione in 500 microlitri di triolo. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius o tenerli in ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA Le variazioni dell'espressione proteica dovute al knockdown dell'RNA SI possono essere valutate in modo sensibile migliorando la tradizionale colorazione immunologica DAB tramite l'intensificazione dell'argento e la successiva quantificazione densimetrica. Qui è mostrato il paradigma di registrazione elettrofisiologica della coltura a fette in cui un micro elettrodo di registrazione viene posizionato nello strato di tre neuroni parametallici CA e un elettrodo stimolante bipolare viene posizionato nel giro dentato.

Ecco un esempio dei potenziali di campo CA tre evocati dalla stimolazione del giro dentato, che viene utilizzata per stabilire la risposta semimassimale qui mostra le risposte potenziali di campo CA tre a raffiche di 10 hertz rimaste che sono state progressivamente aumentate in un'intensità tale da innescare la depressione diffusa. In basso a destra. Qui è mostrata una cellula immunitaria vitale esemplare.

Questa imaging dimostra per la prima volta che una frazione di microglia si muove per lunghe distanze in un modello di ricerca ottimale, come indicato in rosso, noto come voli di prelievo, che sono inversamente proporzionali all'attività sinaptica. L'amplificazione preliminare del CDNA consente la rilevazione dell'IFN gamma in colture di fette ippocampali. Inizialmente, la TC per un gene di riferimento RPL 13 A era 20,5 e l'IFN gamma non era rilevabile a sinistra.

Tuttavia, dopo l'amplificazione di Preem indicata a destra, l'IFN gamma è stato facilmente rilevato a 29,0. Con RPL 13 A che si registra a 14,1 per indicare un aumento di 12 volte dell'amplificazione del segnale, qui viene mostrata la conferma immunoistochimica di un'efficienza. L'intensificazione differenziata dell'argento della perossidasi diammina benzina immuno colorazione viene utilizzata per quantificare la significativa riduzione della produzione di ciclofilina B nelle colture di fette di ippocampo trattate con siRNA Una volta padroneggiata.

Le tecniche descritte in questo video possono essere eseguite nell'arco di diversi giorni. Desideriamo sottolineare che le nostre colture di fette di ippocampo si avvicinano molto alla loro controparte in vivo e sono ideali per studiare la segnalazione immunitaria e la diffusione della depressione. Tuttavia, è essenziale mantenere l'ambiente immunitario quiescente sotto controllo e in condizioni fittizie.

Per ridurre al minimo l'attivazione immunitaria confondente, le colture devono essere mantenute in condizioni sterili. Non devono essere esposti a eccessive perturbazioni chimiche, meccaniche o termiche. Poiché la segnalazione fisiologica delle citochine avviene a livello femtomolare, è necessario applicare tecniche di misurazione altamente sensibili e riproducibili.

Utilizziamo la tecnologia PCRA e tecniche di proteomica sensibile. Infine, le citochine sono sia pleiotropiche che ridondanti. Secondo. I bersagli multiplex delle citochine, misurati nel tempo, sono utili per studiare come la segnalazione immunitaria modula la suscettibilità alla distorsione, alla depressione e, per estensione, all'emicrania.