Name: A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri un metodo di ibridazione in situ ad alto rendimento per visualizzare i pattern di espressione dell'mRNA nel tratto urogenitale inferiore fetale del topo. Questa tecnica facilita lo studio della biologia dello sviluppo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Lan Yi, Cancer Institute del New Jersey, per l&#39;assistenza tecnica nella preparazione di cestini dei tessuti. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Borse Salute DK083425 e DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando il metodo descritto qui, è possibile rilevare mRNA in tutti i tipi di cellule importanti e compartimenti delle LUT fetale topo maschio e femmina anche le pastiglie mesenchimali, urotelio, muscolo liscio, germogli della prostata, del dotto eiaculatorio, e la vagina. Le sezioni di 50 micron utilizzati in questo protocollo hanno il vantaggio di essere abbastanza spessa per risolvere architettura dei tessuti (come i vasi sanguigni), ma sono abbastanza sottili per evitare di cattura della sonda, che è un problema...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Anticorpi anti-digossigenina, frammenti Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blocco reagente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Viola substrato AP, precipitando </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Piastra di coltura cellulare, 24 e </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digossigenina 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Doppio taglio lama di rasoio </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modello classico </td></tr><tr><td> Eliminase RNasi rimozione </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel estrazione kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide, soluzione al 25% in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Eparina, sale di sodio </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, soluzione al 30% in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisolo </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 rapido set adesivi istantanei </td><td> Henkel Corp. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Acido maleico </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Microprovette, 1,5 ml </td><td> Biologix Società di ricerca </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell cultura inserto piatto </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecolare resina rettifica </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldeide, soluzione al 4% in tampone fosfato salino </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampone fosfato, senza Ca e Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> In poliestere, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Piccole parti Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinasi K soluzione, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Colonne </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q soluzione </td><td> Qiagen </td><td> Dotato di Taq DNA polimerasi </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> Inibitore della RNasi </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 DNasi RNasi-free </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque bassa temperatura di fusione agarosio </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Pecore siero </td><td> Sigma </td><td> S2263-500mL </td></tr><tr><td> Stericup filtro unità, 0.22μm, polietersulfone, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Sodio azide, granulare </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecil solfato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, soluzione 20X </td><td> Prodotti di Ricerca Internazionale </td><td> S24022-4.000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III del primo filone di sintesi del sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrante microtomo con bagno campione di lusso </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Lievito tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mrna del mouse fetale basso tratto urogenitale

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Lo sviluppo del basso tratto urogenitale (LUT) è un processo complesso. Questa complessità è evidenziato durante la formazione della prostata dall&#39;uretra del feto maschio, che si basa sui segnali androgeni ed epiteliali-mesenchimali 1,2 interazioni. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili dello sviluppo della prostata può rivelare i meccanismi di crescita che sono impropriamente risvegliato più tardi nella vita per dare origine a malattie della prostata, come l&#39;iperplasia prostatica benigna e cancro alla prostata. La LUT via di sviluppo è anatomicamente complessa. Con il tempo prostatica in erba inizia a 16,5 dopo il concepimento giorni (DPC), numerosi tipi di cellule sono presenti. Vasi, nervi e muscolatura liscia soggiornare nel mesenchimali stroma 3. Questo stroma circonda un epitelio stratificato e dà luogo alla prostata del feto attraverso segnali paracrini recettore androgeno-dipendente 4. L&#39;identità del stromali recettore androgeno-responsive geni necessari per lo sviluppo della prostata e il meccanismo con cui le forme della prostata dell&#39;epitelio duttale in risposta a questi geni non è del tutto chiaro. La capacità di identificare con precisione i tipi di cellule e localizzare l&#39;espressione di fattori specifici al loro interno è fondamentale per capire meglio lo sviluppo della prostata. Ibridazione in situ (ISH) consente per la localizzazione degli mRNA all&#39;interno di un tessuto. Così, questo metodo può essere utilizzato per identificare modello e tempi di espressione di molecole di segnalazione e dei loro recettori, in modo da chiarire i regolatori della prostata potenziale di sviluppo. Qui, descriviamo un elevato tecnica ISH throughput per individuare i pattern di espressione di mRNA nella LUT topo fetale mediante vibrazione microtomo taglio sezioni. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli ISH. L&#39;esecuzione di ISH su sezioni sottili aderito a una diapositiva è tecnicamente difficile; criosezioni hanno spesso scarsa qualità strutturali, mentre sia criosezioni e sezioni di paraffina spesso sfociano nella risoluzione del segnale debole. L&#39;esecuzione di ISH su tutta tessuti monte può causare intrappolamento sonda. Al contrario, la nostra tecnica utilizza un throughput elevato spessore taglio sezioni che rivelano l&#39;architettura dettagliata dei tessuti. Tubi microcentrifuga modificato consentire un&#39;agevole manipolazione delle sezioni durante la procedura ISH. Un massimo di 4 trascritti di mRNA può essere schermato da una LUT singolo 17.5dpc fino a 24 trascritti mRNA rilevato in un unico passaggio, riducendo così i costi e massimizzare l&#39;efficienza. Questo metodo permette di gruppi di trattamento più da lavorare in modo identico e come una singola unità, eliminando ogni pregiudizio per l&#39;interpretazione dei dati. La maggior parte pertinente per i ricercatori della prostata, questo metodo fornisce una posizione spaziale e temporale delle trascrizioni abbondanza bassa e alta mRNA nell&#39;uretra topo fetale che dà origine alla rete prostata duttale.

Qui, descriviamo un throughput efficiente alto<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (ISH) metodo per la visualizzazione di modelli di espressione di mRNA nello sviluppo fetale del mouse sezioni di tessuto prostatico. Il metodo può essere facilmente adattato per visualizzare pattern di espressione di mRNA nei tessuti del mouse o in tessuti di altre specie.

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Lo sviluppo del tratto urogenitale inferiore (LUT) è un processo intricato. Tale complessità emerge durante la formazione della prostata a partire dal maschio fetale...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA nei tessuti fetali in via di sviluppo del tratto urogenitale inferiore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando una sonda ribonucleotidica marcata con digossigenina a partire da un template generato mediante PCR. Il secondo passaggio della procedura consiste nel produrre sezioni spesse utilizzando un microtomo a vibrazione.Il terzo passaggio consiste nell'eseguire un'ibridazione in situ su sezioni del tratto urogenitale inferiore contenute in cestelli personalizzati. Gli mRNA vengono visualizzati mediante rilevamento immunoistochimico delle sonde a RNA legate, utilizzando il substrato BM purple precipitante per la fosfatasi alcalina. Infine, la microscopia può mostrare la localizzazione spaziale e temporale di trascritti mRNA a bassa e alta abbondanza nel tratto urogenitale inferiore del topo fetale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunohistochimica è che le sonde ribo sono facili da generare e possono essere progettate per riconoscere la maggior parte degli mRNA nell'intero genoma del topo. Sebbene questo metodo fornisca informa

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A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale (Video) | JoVE Journal

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

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