A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA nei tessuti del tratto urogenitale inferiore del topo fetale in via di sviluppo. Ciò si ottiene sintetizzando prima una sonda di ossigeno in ribo marcata da un modello generato dalla PCR. La seconda fase della procedura consiste nel generare sezioni tagliate spesse utilizzando un microtomo vibrante.

Il terzo passo consiste nel condurre un'ibridazione in situ in sezioni del tratto urogenitale inferiore contenute in cestelli personalizzati. Gli mRNA vengono visualizzati attraverso la rilevazione immunoistochimica di sonde ribo legate utilizzando il substrato di fosfatasi alcalina precipitante viola BM. In definitiva, la microscopia può mostrare la localizzazione spaziale e temporale di trascritti di mRNA a bassa e alta abbondanza nel tratto urogenitale inferiore del topo fetale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunoistochimica è che le sonde ribo sono facili da generare e possono essere fatte per riconoscere la maggior parte degli mRNA nell'intero genoma del topo. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui modelli di espressione dell'mRNA durante lo sviluppo urinario genitale fetale del topo, può essere applicato anche ad altri sistemi di organi, specie e stadi di sviluppo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'inclusione del tessuto nella coclea può essere difficile da imparare e poiché lievi variazioni nell'orientamento possono portare a risultati incoerenti Almeno un giorno prima di preparare il tessuto, rimuovere e scartare la membrana da una piastra di coltura cellulare milli di 12 millimetri di diametro mentre inserire l'anello rimanente funzionerà come uno stampo immergere gli anelli durante la notte in una soluzione inibitrice di RNA.

Il giorno del protocollo, sezionare un tratto urogenitale inferiore di topo che è stato reidratato con metanolo graduato. I lavaggi PBS tween scartano circa due terzi della vescica e immagazzinano il restante tessuto del tratto urogenitale inferiore in PBS tween. Ora posiziona uno stampo ad anello trattato su un vetrino da microscopio in vetro e riempilo con una soluzione di sale a basso punto di fusione al 4% a 62 gradi Celsius e lascialo raffreddare per circa due minuti.

Ora, bloccare asciugare il tessuto del tratto urogenitale inferiore e immergerlo nella soluzione di rinascita. Usa una pinza per orientare il tessuto in modo che sia sospeso a metà strada tra la parte superiore e inferiore dell'anello. La muffa incuba a quattro gradi Celsius fino a quando la muffa non si è solidificata.

Prima di affettare il fazzoletto, preparare una lama wilkinson personalizzata risciacquando con solventi, quindi con acqua. Separare la doppia lama nel senso della lunghezza in due lame singole. Quindi, sostenere la lama Wilkinson con una lama microtone.

Per fare ciò, per prima cosa, taglia la lama microtone alla lunghezza della lama Wilkinson. Quindi, utilizzando un adesivo Lock Tite, incollare la lama in microtono alla lama Wilkinson sfalsata dal tagliente di circa tre o quattro millimetri. Ora monta la lama rinforzata nel microtomo vibrante e imposta l'angolo della lama a 35 gradi.

Prepara il bagno deluxe riempiendo il bagno con PBS e impacchettando ghiaccio umido attorno ad esso. Prima di montare il fazzoletto incorporato nel tappo, rimuoverlo dallo stampo ad anello e bloccare la superficie inferiore asciutta. Quindi incollare la superficie asciutta al disco di montaggio utilizzando l'adesivo Loctite.

Inserire il disco nel vibratore e regolare lo spessore della sezione a 50 micron, la velocità a due e l'ampiezza della lama a quattro. Durante il taglio di sezioni di tessuto, utilizzare una pinza smussata per trasferire ciascuna sezione su una piastra di coltura a 24 pozzetti riempita con mezzo millilitro di interpolazione PBS ghiacciata. Dopo l'affettatura, rimuovere la maggior parte degli aros da ciascuna sezione di tessuto utilizzando le forbici a molla prima di iniziare l'ibridazione INI, le sezioni possono essere conservate per un massimo di 48 ore a quattro gradi Celsius in interpolazione PBS contenente due millimolari di azoturo di sodio.

Innanzitutto, crea cestelli per campioni personalizzati tagliando il fondo di una provetta per microcentrifuga al segno di 100 microlitri. Scaldare il taglio del tubo a fiamma fino a quando la plastica non sarà morbida. Quindi premere con decisione la plastica morbida su un quadrato a rete.

Lasciarlo indurire e tagliare la rete in eccesso. Completare i cestelli utilizzando un ago riscaldato calibro 18 per praticare due fori in ciascun coperchio del tubo. Creare un vassoio per contenere i cestelli dei campioni praticando 24 fori da 12 millimetri equidistanti nel coperchio di una piastra da 24 pozzetti.

Ogni foro deve essere posizionato direttamente sopra un pozzo prima di iniziare a preriscaldare una camera di ibridazione coperta riempita con mezzo pollice di acqua di rubinetto a 60,5 gradi Celsius. Iniziare l'ibridazione in situ aggiungendo due millilitri di interpolazione PBS a ciascun pozzetto della piastra di coltura a 24 pozzetti. Coprire questo piatto con il coperchio preparato caricato con i cestelli.

Ora trasferire le sezioni di tessuto nei cestelli a temperatura ambiente con l'oscillazione incubare le sezioni in perossido di idrogeno al 6% con interpolazione PBS, seguita da una serie di lavaggi con interpolazione PBS, un'incubazione con proteinasi K, un'altra fissazione e altri lavaggi. Per terminare la preparazione dei campioni, aggiungere due millilitri del tampone di ibridazione prebellica a ciascun pozzetto e incubare la piastra all'interno della camera di ibridazione riscaldata per almeno un'ora. Avviare l'ibridazione aggiungendo 0,5 microgrammi di sonda RIBA marcata a ciascuno.

Bene, allora continuate l'incubazione per una notte all'interno della camera di ibridazione riscaldata. Il giorno successivo lavare i fazzoletti con la soluzione uno che passa gradualmente alla soluzione due, quindi trattare con RNA. Quindi lavare nella soluzione tre, seguito da lavaggi in TBS tween e tampone di blocco tissutale mentre i tessuti sono in incubazione nel tampone di blocco tissutale.

Iniziare un'incubazione di almeno due ore dell'anticorpo anti dig nel tampone di assorbimento degli anticorpi a quattro gradi Celsius dopo il periodo di incubazione. Far girare la soluzione anticorpale a 10.000 giri/min per un minuto. Per rimuovere i solubili, aggiungere la Senna a due millilitri di tampone in soluzione anticorpale.

A questo punto, rimuovere il tessuto dal tampone bloccante e incubarlo nella soluzione anticorpale preparata. Conservali in una camera di ibridazione per una notte di quattro gradi Celsius il terzo giorno della procedura. Lavare più volte i fazzoletti in TBST con l'ole.

Usando poi una pipetta di vetro per pasta. Trasferire con cura i fazzoletti in provette pulite per microcentrifuga. Lavare i fazzoletti per 10 minuti con un millilitro di NTM a vuoto.

Quindi sostituire la soluzione con TMT contenente lava sole MBM viola. Posizionare i tubi al buio e nei giorni successivi, monitorare lo sviluppo del colore e cambiare la soluzione secondo necessità. Dopo lo sviluppo completo del colore, lavare brevemente i fazzoletti con TMT contenente lava e poi incubarli per una notte a quattro gradi Celsius in PBS contenente paraformaldeide.

Il giorno dopo candeggina e lavaggio dei fazzoletti. Le sezioni sono ora pronte per l'imaging. Il tessuto del tratto urogenitale inferiore era incorporato nell'agar in modo tale che la linea mediana uretrale fosse parallela alla superficie piatta del tappo aros.

Questo orientamento ha prodotto sezioni sagittali. I cestelli per campioni realizzati su misura hanno protetto le delicate sezioni di tessuto da polvere e particolato. Durante la procedura di ibridazione di più giorni in C due.

Hanno anche impedito la perdita di qualsiasi sezione. È difficile limitare la colorazione di fondo durante le lunghe incubazioni necessarie per rilevare mRNA a bassa abbondanza. Tuttavia, l'aggiunta di sodio azide e la successiva filtrazione sembrano avere una colorazione di fondo limitata.

Inoltre, non c'erano differenze visibili nella colorazione di fondo quando i campioni sono stati incubati in soluzione di sviluppo del colore per periodi di tempo prolungati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei giorni se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'immunoistochimica per determinare se il pattern di espressione dell'mRNA è correlato al pattern di espressione delle proteine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA e il topo in via di sviluppo abbassa il tratto genitale.