Name: A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri un metodo di ibridazione in situ ad alto rendimento per visualizzare i pattern di espressione dell'mRNA nel tratto urogenitale inferiore fetale del topo. Questa tecnica facilita lo studio della biologia dello sviluppo.

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Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Lan Yi, Cancer Institute del New Jersey, per l&#39;assistenza tecnica nella preparazione di cestini dei tessuti. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Borse Salute DK083425 e DK070219.

<ol><li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+possible+influence+of+temporal+factors+in+androgenic+responsiveness+of+urogenital+tissue+recombinants+from+wild-type+and+androgen-insensitive+%28Tfm%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">The possible influence of temporal factors in androgenic responsiveness of urogenital tissue recombinants from wild-type and androgen-insensitive (Tfm) mice.</a> Journal of Experimental Zoology. 205, 181-181 (1978).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal%2C+cellular%2C+and+molecular+regulation+of+normal+and+neoplastic+prostatic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hormonal, cellular, and molecular regulation of normal and neoplastic prostatic development.</a> Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 92, 221-221 (2004).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+development+and+structure+in+the+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22National+Cancer+Institute+Monographs%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of development and structure in the prostate.</a> National Cancer Institute Monographs. 12, 1-1 (1963).</li>
<li>Cunha, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions--I.+Induction+of+prostatic+phenotype+in+urothelium+of+testicular+feminized+%28Tfm%2Fy%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Steroid+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions--I. Induction of prostatic phenotype in urothelium of testicular feminized (Tfm/y) mice.</a> Journal of Steroid Biochemistry. 14, 1317-1317 (1981).</li>
<li>Rozen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3+on+the+WWW+for+general+users+and+for+biologist+programmers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers.</a> Methods in Molecular Biology. 132, 365-365 (2000).</li>
<li>Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+greedy+algorithm+for+aligning+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">A greedy algorithm for aligning DNA sequences.</a> Journal of Computational Biology. 7, 203-203 (2000).</li>
<li>Vezina, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dioxin+causes+ventral+prostate+agenesis+by+disrupting+dorsoventral+patterning+in+developing+mouse+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dioxin causes ventral prostate agenesis by disrupting dorsoventral patterning in developing mouse prostate.</a> Toxicological Sciences. 106, 488-488 (2008).</li>
<li>Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+messenger+RNA+by+in+situ+hybridization+to+tissue+sections+and+whole+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts.</a> Methods in Enzymology. 225, 361-361 (1993).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando il metodo descritto qui, è possibile rilevare mRNA in tutti i tipi di cellule importanti e compartimenti delle LUT fetale topo maschio e femmina anche le pastiglie mesenchimali, urotelio, muscolo liscio, germogli della prostata, del dotto eiaculatorio, e la vagina. Le sezioni di 50 micron utilizzati in questo protocollo hanno il vantaggio di essere abbastanza spessa per risolvere architettura dei tessuti (come i vasi sanguigni), ma sono abbastanza sottili per evitare di cattura della sonda, che è un problema...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Anticorpi anti-digossigenina, frammenti Fab </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11214667001 </td></tr><tr><td> Blocco reagente </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11096176001 </td></tr><tr><td> BM Viola substrato AP, precipitando </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11442074001 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td></tr><tr><td> Piastra di coltura cellulare, 24 e </td><td> Corning </td><td> 3524 </td></tr><tr><td> Digossigenina 11-UTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 1277073910 </td></tr><tr><td> dNTP </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11969064001 </td></tr><tr><td> Doppio taglio lama di rasoio </td><td> Wilkinson Sword </td><td> Modello classico </td></tr><tr><td> Eliminase RNasi rimozione </td><td> Decon Laboratories </td><td> 1102 </td></tr><tr><td> Formammide </td><td> Sigma </td><td> F5786-1L </td></tr><tr><td> Gel estrazione kit </td><td> Qiagen </td><td> 28704 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide, soluzione al 25% in H 2 O </td><td> Sigma </td><td> G6257-100ML </td></tr><tr><td> Eparina, sale di sodio </td><td> Sigma </td><td> H3393 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, soluzione al 30% in H 2 O </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP2633-500 </td></tr><tr><td> Levamisolo </td><td> Sigma </td><td> L9756 </td></tr><tr><td> Loctite 404 rapido set adesivi istantanei </td><td> Henkel Corp. </td><td> 46551 </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio </td><td> Fisher Scientific </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> Acido maleico </td><td> Sigma </td><td> M0375-500G </td></tr><tr><td> Microprovette, 1,5 ml </td><td> Biologix Società di ricerca </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Millicell cultura inserto piatto </td><td> Millipore </td><td> PICM01250 </td></tr><tr><td> Molecolare resina rettifica </td><td> G-Biosciences </td><td> 786-138PR </td></tr><tr><td> Paraformaldeide, soluzione al 4% in tampone fosfato salino </td><td> Affymetrix </td><td> 19943 </td></tr><tr><td> Tampone fosfato, senza Ca e Mg </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1760420 </td></tr><tr><td> In poliestere, 33 micron, 12 &quot;x 24&quot; </td><td> Piccole parti Inc </td><td> CMY-0033-D </td></tr><tr><td> Proteinasi K soluzione, 20mg/ml </td><td> Amresco </td><td> E195-5ML </td></tr><tr><td> QIAshredder Colonne </td><td> Qiagen </td><td> 79654 </td></tr><tr><td> Q soluzione </td><td> Qiagen </td><td> Dotato di Taq DNA polimerasi </td></tr><tr><td> RNasi </td><td> Sigma </td><td> R6513 </td></tr><tr><td> Inibitore della RNasi </td><td> Roche Applied Science </td><td> 03335399001 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RNeasy mini kit </td><td> Qiagen </td><td> 74104 </td></tr><tr><td> RQ1 DNasi RNasi-free </td><td> Promega </td><td> M6101 </td></tr><tr><td> SeaPlaque bassa temperatura di fusione agarosio </td><td> Lonza </td><td> 50101 </td></tr><tr><td> Pecore siero </td><td> Sigma </td><td> S2263-500mL </td></tr><tr><td> Stericup filtro unità, 0.22μm, polietersulfone, 500mL </td><td> Millipore </td><td> SCGPU05RE </td></tr><tr><td> Sodio azide, granulare </td><td> Fisher Scientific </td><td> S227I-100 </td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP358-212 </td></tr><tr><td> Dodecil solfato di sodio </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529-500 </td></tr><tr><td> SSC, soluzione 20X </td><td> Prodotti di Ricerca Internazionale </td><td> S24022-4.000,0 </td></tr><tr><td> SuperScript III del primo filone di sintesi del sistema </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-051 </td></tr><tr><td> T7 RNA polimerasi </td><td> Roche Applied Science </td><td> 10881767001 </td></tr><tr><td> Taq DNA polimerasi </td><td> Qiagen </td><td> 201203 </td></tr><tr><td> Tris-HCl </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP153-1 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Vibrante microtomo con bagno campione di lusso </td><td> Leica Microsystems </td><td> VT1000A </td></tr><tr><td> Lievito tRNA </td><td> Roche Applied Science </td><td> 109495 </td></tr></tbody></table>

a high throughput in situ metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mrna del mouse fetale basso tratto urogenitale

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Lo sviluppo del basso tratto urogenitale (LUT) è un processo complesso. Questa complessità è evidenziato durante la formazione della prostata dall&#39;uretra del feto maschio, che si basa sui segnali androgeni ed epiteliali-mesenchimali 1,2 interazioni. Comprensione dei meccanismi molecolari responsabili dello sviluppo della prostata può rivelare i meccanismi di crescita che sono impropriamente risvegliato più tardi nella vita per dare origine a malattie della prostata, come l&#39;iperplasia prostatica benigna e cancro alla prostata. La LUT via di sviluppo è anatomicamente complessa. Con il tempo prostatica in erba inizia a 16,5 dopo il concepimento giorni (DPC), numerosi tipi di cellule sono presenti. Vasi, nervi e muscolatura liscia soggiornare nel mesenchimali stroma 3. Questo stroma circonda un epitelio stratificato e dà luogo alla prostata del feto attraverso segnali paracrini recettore androgeno-dipendente 4. L&#39;identità del stromali recettore androgeno-responsive geni necessari per lo sviluppo della prostata e il meccanismo con cui le forme della prostata dell&#39;epitelio duttale in risposta a questi geni non è del tutto chiaro. La capacità di identificare con precisione i tipi di cellule e localizzare l&#39;espressione di fattori specifici al loro interno è fondamentale per capire meglio lo sviluppo della prostata. Ibridazione in situ (ISH) consente per la localizzazione degli mRNA all&#39;interno di un tessuto. Così, questo metodo può essere utilizzato per identificare modello e tempi di espressione di molecole di segnalazione e dei loro recettori, in modo da chiarire i regolatori della prostata potenziale di sviluppo. Qui, descriviamo un elevato tecnica ISH throughput per individuare i pattern di espressione di mRNA nella LUT topo fetale mediante vibrazione microtomo taglio sezioni. Questo metodo offre diversi vantaggi rispetto ad altri protocolli ISH. L&#39;esecuzione di ISH su sezioni sottili aderito a una diapositiva è tecnicamente difficile; criosezioni hanno spesso scarsa qualità strutturali, mentre sia criosezioni e sezioni di paraffina spesso sfociano nella risoluzione del segnale debole. L&#39;esecuzione di ISH su tutta tessuti monte può causare intrappolamento sonda. Al contrario, la nostra tecnica utilizza un throughput elevato spessore taglio sezioni che rivelano l&#39;architettura dettagliata dei tessuti. Tubi microcentrifuga modificato consentire un&#39;agevole manipolazione delle sezioni durante la procedura ISH. Un massimo di 4 trascritti di mRNA può essere schermato da una LUT singolo 17.5dpc fino a 24 trascritti mRNA rilevato in un unico passaggio, riducendo così i costi e massimizzare l&#39;efficienza. Questo metodo permette di gruppi di trattamento più da lavorare in modo identico e come una singola unità, eliminando ogni pregiudizio per l&#39;interpretazione dei dati. La maggior parte pertinente per i ricercatori della prostata, questo metodo fornisce una posizione spaziale e temporale delle trascrizioni abbondanza bassa e alta mRNA nell&#39;uretra topo fetale che dà origine alla rete prostata duttale.

Qui, descriviamo un throughput efficiente alto<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazione (ISH) metodo per la visualizzazione di modelli di espressione di mRNA nello sviluppo fetale del mouse sezioni di tessuto prostatico. Il metodo può essere facilmente adattato per visualizzare pattern di espressione di mRNA nei tessuti del mouse o in tessuti di altre specie.

A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale

Lo sviluppo del tratto urogenitale inferiore (LUT) è un processo intricato. Tale complessità emerge durante la formazione della prostata a partire dal maschio fetale...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA nei tessuti fetali in via di sviluppo del tratto urogenitale inferiore del topo. Questo viene ottenuto innanzitutto sintetizzando una sonda ribonucleotidica marcata con digossigenina a partire da un template generato mediante PCR. Il secondo passaggio della procedura consiste nel produrre sezioni spesse utilizzando un microtomo a vibrazione.Il terzo passaggio consiste nell'eseguire un'ibridazione in situ su sezioni del tratto urogenitale inferiore contenute in cestelli personalizzati. Gli mRNA vengono visualizzati mediante rilevamento immunoistochimico delle sonde a RNA legate, utilizzando il substrato BM purple precipitante per la fosfatasi alcalina. Infine, la microscopia può mostrare la localizzazione spaziale e temporale di trascritti mRNA a bassa e alta abbondanza nel tratto urogenitale inferiore del topo fetale.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'immunohistochimica è che le sonde ribo sono facili da generare e possono essere progettate per riconoscere la maggior parte degli mRNA nell'intero genoma del topo. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sui modelli di espressione degli mRNA durante lo sviluppo genito-urinario fetale del topo, può essere applicato anche ad altri sistemi organici, specie e stadi di sviluppo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'inclusione del tessuto nell'auger può risultare difficile da apprendere e perché piccole variazioni nell'orientamento possono portare a risultati non uniformi. Almeno un giorno prima della preparazione del tessuto, rimuovere e scartare la membrana da una piastra per colture cellulari milli di diametro di 12 millimetri, mentre l'anello rimanente fungerà da stampo; lasciare in ammollo gli anelli per tutta la notte in una soluzione inibitrice di RNAsi.Nel giorno del protocollo, dissezionare il tratto urogenitale inferiore di un topo che è stato reidratato con metanolo in gradiente. Dopo lavaggi con PBS tween, scartare circa due terzi della vescica e conservare il tessuto rimanente del tratto urogenitale inferiore in PBS tween. Posizionare ora un stampo ad anello trattato su un vetrino di vetro e riempirlo con una soluzione al 4% di agarosio a basso punto di fusione a 62 gradi Celsius, lasciando raffreddare per circa due minuti.Ora, bloccare e asciugare il tessuto del tratto urogenitale inferiore e immergerlo nella soluzione di agarosio. Utilizzare pinzette per orientare il tessuto in modo che rimanga sospeso a metà strada tra la parte superiore e quella inferiore dell'anello. Incubare in coltura a quattro gradi Celsius fino a quando l'agarosio si sarà solidificato.Prima di sezionare il tessuto, preparare una lama Wilkinson personalizzata sciacquandola con solventi, seguiti da acqua. Separare la lama doppia longitudinalmente in due lame singole. Successivamente, sostenere la lama Wilkinson con una lama per microtomo.Per fare ciò, innanzitutto tagliare la lama del microtomo alla lunghezza della lama Wilkinson. Quindi, utilizzando una colla adesiva Lock Tite, incollare la lama del microtomo alla lama Wilkinson sfalsandola rispetto al bordo tagliente di circa tre o quattro millimetri. Ora montare la lama rinforzata nel microtomo vibrante e impostare l'angolo della lama a 35 gradi.Preparare il bagno per campioni di lusso riempiendo il bagno con PBS e disponendo del ghiaccio bagnato attorno ad esso. Prima di montare il tessuto incluso nel tappo, rimuoverlo dallo stampo ad anello e asciugare delicatamente la superficie inferiore. Quindi incollare la superficie asciutta al disco di montaggio utilizzando adesivo Loctite.Inserire il disco nel vibratomo e regolare lo spessore della sezione a 50 micron, la velocità a due e l'ampiezza della lama a quattro. Durante il taglio delle sezioni di tessuto, utilizzare pinze smussate per trasferire ciascuna sezione in una piastra da coltura a 24 pozzetti riempita con mezzo millilitro di PBS tween ghiacciato. Dopo il taglio, rimuovere la maggior parte dell'aros intorno a ciascuna sezione di tessuto utilizzando forbici a molla prima di iniziare l'ibridazione INI; le sezioni possono essere conservate fino a 48 ore a quattro gradi Celsius in PBS tween contenente azide di sodio 2 millimolare.Per prima cosa, preparare dei contenitori personalizzati per campioni tagliando il fondo di una provetta da microcentrifuga al segno di 100 microlitri. Riscaldare il bordo tagliato della provetta in una fiamma fino a quando la plastica diventa morbida. Quindi premere saldamente la plastica ammorbidita su un quadrato di rete metallica.Lasciarlo indurire e tagliare la rete in eccesso. Completare i cestelli utilizzando un ago caldo da 18 gauge per forare due fori in ciascun tappo del tubo. Preparare un vassoio per contenere i cestelli del campione praticando 24 fori da 12 millimetri equidistanti nel coperchio di una piastra a 24 pozzetti.Ogni foro deve essere posizionato direttamente sopra una pozzetta prima di iniziare a preriscaldare una camera di ibridazione coperta, riempita con mezzo pollice di acqua di rubinetto, fino a 60,5 gradi Celsius. Iniziare l'ibridazione in situ aggiungendo due millilitri di PBS tween in ciascuna pozzetta della piastra da coltura a 24 pozzette. Coprire questa piastra con il coperchio preparato, caricato con i cestelli.Trasferire ora le sezioni di tessuto nei cestelli a temperatura ambiente, incubando con agitazione in perossido di idrogeno al 6% in PBS tween, seguito da una serie di lavaggi con PBS tween, un'incubazione con proteinasi K, un'ulteriore fissazione e altri lavaggi. Per completare la preparazione dei campioni, aggiungere due millilitri di tampone di pre-ibridazione preriscaldato in ciascun pozzetto e incubare la piastra all'interno della camera di ibridazione riscaldata per almeno un'ora. Avviare l'ibridazione aggiungendo 0,5 microgrammi di sonda RIBA marcata a ciascun pozzetto.Bene, proseguire l'incubazione tutta la notte all'interno della camera riscaldata per ibridazione. Il giorno successivo, lavare i tessuti con la soluzione uno, passando gradualmente alla soluzione due, quindi trattare con RNA. Successivamente, lavare nella soluzione tre, seguito da lavaggi in TBS tween e tampone di bloccaggio del tessuto, mentre i tessuti sono in incubazione nel tampone di bloccaggio del tessuto.Iniziare un'incubazione di almeno due ore dell'anticorpo anti-dig nel buffer di assorbimento degli anticorpi a quattro gradi Celsius dopo il periodo di incubazione. Centrifugare la soluzione anticorpale a 10.000 giri al minuto per un minuto. Per rimuovere i componenti insolubili, aggiungere la Senna a due millilitri di soluzione anticorpale in buffer.Ora rimuovere il tessuto dal buffer di blocco e incubarlo nella soluzione di anticorpo preparata. Mantenerli in una camera di ibridazione tutta la notte a quattro gradi Celsius nel terzo giorno della procedura. Lavare i tessuti diverse volte in TBST con l'ole.Quindi, utilizzando una pipetta di vetro per pasta, trasferire con attenzione i tessuti in provette microcentrifuga pulite. Lavare i tessuti per 10 minuti con un millilitro di NTM vuoto.Quindi sostituire la soluzione con TMT contenente lava sole MBM viola. Collocare i tubi al buio e nei giorni successivi monitorare lo sviluppo del colore e cambiare la soluzione secondo necessità. Dopo lo sviluppo completo del colore, lavare brevemente i tessuti con TMT contenente lava so e poi incubarli tutta la notte a quattro gradi Celsius in PBS contenente paraformaldeide.Il giorno successivo, trattare i tessuti con candeggina e lavarli. Le sezioni sono ora pronte per l'analisi mediante imaging. Il tessuto del tratto urogenitale inferiore è stato incluso in agar in modo che la linea mediana uretrale fosse parallela alla superficie piana del tappo di agarosio.Questa orientazione ha prodotto sezioni sagittali. Appositi cestelli per campioni proteggevano le sezioni di tessuto delicate da polvere e particelle. Durante la procedura di ibridazione in situ a due ibridi di più giorni.Hanno inoltre impedito la perdita di eventuali sezioni. È difficile ridurre al minimo la colorazione di fondo durante le lunghe incubazioni necessarie per rilevare mRNA a bassa abbondanza. Tuttavia, l'aggiunta di azoturo di sodio e la successiva filtrazione sembrano aver limitato la colorazione di fondo.Inoltre, non sono state osservate differenze visibili nella colorazione di fondo quando i campioni sono stati incubati nella soluzione di sviluppo del colore per periodi di tempo prolungati. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei giorni se eseguita correttamente. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come l'immunohistochimica possono essere eseguiti per determinare se il profilo di espressione degli mRNA corrisponde al profilo di espressione delle proteine.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare i modelli di espressione dell'mRNA e lo sviluppo del tratto genitale inferiore del topo.

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A High Throughput In situ Metodo di ibridazione di caratterizzare gli schemi di espressione di mRNA del mouse fetale basso tratto urogenitale (Video) | JoVE Journal

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