Un In Vitro Sistema per studio dormienza tumorale e l'interruttore di crescita metastatica

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare in tempo reale e in modo ad alto rendimento l'effetto di potenziali agenti sulla quiescenza delle cellule tumorali e/o sulla loro riattivazione dalla quiescenza tumorale, utilizzando il seguente saggio in vitro per modellare la quiescenza tumorale o la transizione verso una crescita metastatica. Questo risultato si ottiene innanzitutto coltivando cellule tumorali quiescenti e/o metastatiche in un sistema tridimensionale a base di estratto della membrana basale, o sistema BME, adattato a una piastra da 96 pozzetti. Quando coltivate nel sistema 3D, le cellule metastatiche entrano in una fase transitoria, dormiente o quiescente.

Al contrario, le cellule tumorali che sono dormienti in vivo entrano in uno stato di quiescenza prolungato. Nel sistema di coltura 3D, le cellule metastatiche possono quindi essere trattate con agenti candidati per prevenire il passaggio dalla quiescenza alla proliferazione. Mentre le cellule tumorali dormienti possono essere trattate con agenti candidati che potrebbero indurre il loro passaggio dalla quiescenza alla proliferazione.

Il comportamento proliferativo delle cellule dormienti e metastatiche in seguito al trattamento verrà valutato aggiungendo il kit per saggio di proliferazione cellulare Cell Titer 96 Aqueous One Solution nei tempi desiderati per l'analisi mediante lettore di piastre ELIZA. I risultati ottenuti mostrano l'effetto del trattamento sulla proliferazione cellulare di cellule tumorali, siano esse dormienti o metastatiche, basandosi su un saggio di proliferazione cellulare nel sistema 3D. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della metastasi, come quali fattori e meccanismi cellulari mantengono le cellule tumorali disseminate in uno stato di quiescenza e quali fattori e meccanismi cellulari inducono il passaggio dalla dormienza tumorale alla metastasi clinica Thaw.

Il fattore di crescita Qualtrics ha ridotto il BME in un frigorifero a quattro gradi Celsius durante la notte precedente il giorno in cui deve essere eseguito il saggio di proliferazione. Quindi, nel giorno del saggio, selezionare una coltura cellulare di tumore dormiente o metastatico per l'esperimento. Successivamente, posizionare una piastra a 96 pozzetti su un vassoio di ghiaccio all'interno di un lemon o di un cappe.

Quindi utilizzare un dispenser con una siringa per ricoprire ogni pozzetto della piastra con 50 microlitri di BME scongelato e ghiacciato. Assicurarsi che non si formino bolle nei pozzetti; posizionare la piastra a 96 pozzetti ricoperta di BME in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Nel frattempo, posizionare una bottiglia di tripsina a 37 gradi Celsius per riscaldarla mentre la piastra ricoperta di BME è in incubazione.

Aspirare il mezzo dai cellule tumorali. Lavare le piastre di coltura con 10 millilitri di PBS. Quindi aspirare il PBS e aggiungere due millilitri di tripsina preriscaldata alle piastre di coltura.

Incubare le piastre per cinque minuti. Aggiungere cinque millilitri di DMEM ad alto contenuto di glucosio, integrato con FCS al 10% e antibiotici, in un tubo conico da 15 millilitri. Durante questo periodo.

Dopo l'incubazione, trasferire le cellule staccate nel tubo da 15 millilitri e contare le cellule. Successivamente, centrifugare il numero totale di cellule da coltivare in una centrifuga per colture cellulari per cinque minuti a 1500 G a temperatura ambiente. Aspirare con attenzione il surnatante.

Lasciare un po' di mezzo di coltura, poiché nella maggior parte dei casi il pellet non è visibile. Quindi, agitare delicatamente il fondo del tubo per assicurarsi di ottenere una sospensione monocellulare. Successivamente, risospendere il pellet con 100 microlitri di mezzo di saggio per ogni due volte 10 alla terza cellule.

Triturare le cellule più volte con una pipetta da cinque millilitri per assicurare che venga mantenuta una sospensione di singole cellule. Piastrare 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti rivestita con BME per la piastra di controllo del fondo; aggiungere ulteriori 100 microlitri per pozzetto di mezzo sperimentale solo in alcuni pozzetti della piastra da 96 pozzetti rivestita con BME. Incubare quindi le piastre, aspirare il vecchio mezzo e rifornire le cellule con nuovo mezzo sperimentale ogni quattro giorni.

Per valutare la proliferazione cellulare, aggiungere 20 microlitri di soluzione acquosa Cell Titer 96 da un kit per saggio di proliferazione cellulare per pozzetto a ciascuna piastra a 96 pozzetti da analizzare al tempo sperimentale desiderato. Incubare le piastre per due ore. Successivamente, utilizzando un lettore di piastre ELISA, registrare l'assorbanza sia dei pozzetti sperimentali che di quelli di fondo a 490 nanometri in preparazione per l'immunofluorescenza.

Colorazione di molecole di segnalazione cellulare e cellule tumorali: scongelare una BME in un refrigeratore a quattro gradi Celsius durante la notte, il giorno precedente l'esecuzione della colorazione. Il giorno della colorazione, posizionare un sistema di vetrini con otto camere su un vassoio di ghiaccio all'interno di un laminatoio o cappa. Successivamente, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per ricoprire ogni pozzetto del sistema di vetrini con 50 microlitri di BME fredda di ghiaccio.

Assicurarsi che il BME sia distribuito uniformemente e che non si formino bolle nelle pozzette. Incubare i vetrini rivestiti per 20 minuti. Selezionare una linea cellulare tumorale dormiente o metastatica.

Raccogliere le cellule utilizzando la tripsina come descritto in precedenza. Quindi raccogliere il numero totale di cellule da coltivare in un tubo conico da 15 millilitri. Adesso centrifugare le cellule, aspirare con attenzione il soprannatante nuovamente, lasciando un po' di mezzo di coltura.

Per il pellet, battere delicatamente il fondo del tubo conico da 15 millilitri per ottenere una sospensione di cellule singole. Risospendere il pellet con 400 microlitri di mezzo d'assay per ogni cinque volte 10 alla terza cellule. Pipettare più volte le cellule con una pipetta da cinque millilitri per assicurarsi che la sospensione di cellule singole venga mantenuta; aggiungere 400 microlitri di soluzione cellulare per pozzetto in ciascuna delle otto camere rivestite con BME.

Quindi incubare il sistema di vetrini, aspirare il vecchio mezzo e rifornire le cellule con un nuovo mezzo di saggio ogni quattro giorni nei punti temporali sperimentali desiderati. Aspirare lo strato superiore del mezzo e aggiungere 200 microlitri di fissativo integrato con tritone e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aspirare il fissativo contenente tritone e aggiungere soltanto 200 microlitri di fissativo, quindi incubare a temperatura ambiente per ulteriori 25 minuti.

Aspirare nuovamente il fissativo e aggiungere ora 400 microlitri di PBS a ciascun pozzetto. Incubare la piastra per altri 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi aspirare il PBS e aggiungere 400 microlitri di PBS contenente 0,05% compreso tra 20 e incubare per altri 10 minuti.

Allo stesso modo a temperatura ambiente. Ora bloccare le cellule fissate con 200 microlitri di soluzione di blocco. Incubare quindi le cellule a temperatura ambiente per un'ora; al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione di blocco e aggiungere 200 microlitri di anticorpo primario diluito nella soluzione di blocco in ciascun campione.

Incubare bene le vetrate con l'anticorpo primario durante la notte a quattro gradi Celsius il giorno successivo. Aspirare l'anticorpo, quindi lavare i pozzetti tre volte aggiungendo 400 microlitri di PBS per 15 minuti e aspirando successivamente la soluzione ogni volta. Dopo aver aspirato il PBS dall'ultimo lavaggio, aggiungere 200 microlitri di un anticorpo secondario coniugato con rodamina rossa.

Quindi coprire il sistema di otto camere con della pellicola di alluminio e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare le pozzette tre volte con PBS come in precedenza; dopo il terzo lavaggio, montare i vetrini in un mezzo di montaggio beta shield con dpi.

Infine, asciugare le preparazioni per 40 minuti a temperatura ambiente al buio. Qui viene mostrato un esempio di analisi della proliferazione delle cellule tumorali dormienti D 2.0 R e metastatiche D two A one in coltura 3D. Le cellule D 2.0 R rimangono dormienti per tutto il periodo sperimentale di 14 giorni, mentre le cellule altamente metastatiche D two A one rimangono dormienti solo per quattro-sei giorni di coltura, dopo i quali iniziano a proliferare durante la fase iniziale di latenza.

Molte cellule rimangono solitarie nella coltura 3D, come mostrato qui in una foto rappresentativa di una coltura al quarto giorno, mentre altre cellule non proliferanti formano steroidi multicellulari. La transizione delle cellule D two A one da uno stato quiescente a uno stato proliferativo nella coltura 3D è mostrata qui in questa immagine di una coltura al dodicesimo giorno. È associata a cambiamenti drammatici nella morfologia cellulare in questa figura.

Un esempio di un agente che impedisce alle cellule D two A one di passare da uno stato quiescente a uno stato proliferativo è mostrato nei trattamenti delle cellule D two A one con un inibitore specifico della chinasi della catena leggera della miosina. Mantenere le cellule D two A one in uno stato quiescente come illustrato in questa figura. Un significativo aumento della fosforilazione della catena leggera della miosina nelle cellule D two A one in rosso, seguito dalla riorganizzazione dei filamenti di F-actina che formano fibre di stress dell’actina in verde, si verifica durante il loro passaggio dalla quiescenza dai giorni uno a quattro alla proliferazione.

Giorno sette. Tuttavia, l'inibizione dell'attività della chinasi della catena leggera della miosina in cellule D due A uno mediante SHRA o tramite il farmaco ML sette mantiene le cellule D due A uno in uno stato di quiescenza e determina l'inibizione della fosforilazione della catena leggera della miosina, dell'F act e dell'organizzazione delle fibre di stress, come mostrato qui. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come impostare un sistema modello in vitro per studiare la quiescenza tumorale e la transizione verso la crescita metastatica.