Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

L'obiettivo generale di questa procedura è generare un ricostrutto cutaneo umano tridimensionale per studi sulla biologia dei melanociti, del melanoma e delle cellule staminali della pelle. Questo viene ottenuto innanzitutto rivestendo un inserto di piastre per colture cellulari con collagene bovino neutralizzato. Il secondo passaggio consiste nel creare il compartimento dermico cellulare a partire da fibroblasti e collagene.

Successivamente, preparare il compartimento epidermico da cheratinociti mescolati con melanociti o cellule di melanoma. L'ultimo passaggio della procedura consiste nel prelevare un costrutto cutaneo al giorno 18 e nel trapiantare il costrutto cutaneo su un topo. Infine, le analisi immunohistochimiche e immunofluorescenti del trapianto mostrano l'architettura della cute normale contenente melanociti, la migrazione e la differenziazione di cellule staminali normali e fenotipi specifici del melanoma in base allo stadio.

Abbiamo sviluppato il modello di ricostruzione cutanea 20 anni fa perché fin dall'inizio dei nostri studi abbiamo osservato che melanociti normali o cellule di melanoma coltivate in una piastra si comportano in modo molto diverso rispetto alle cellule presenti in un contesto tissutale. Pertanto, il modello di ricostruzione cutanea è ideale per osservare come le cellule si spostino da un compartimento della pelle a un altro. La miscela di collagene acellulare precedentemente preparata viene mantenuta sul ghiaccio e quindi un millilitro della soluzione giallo paglierino viene aggiunto in ciascun inserto di una piastra a sei pozzetti.

Incubare il vassoio per coltura cellulare in un ambiente idoneo per 30 minuti a temperatura ambiente, in modo da permettere al gel di solidificare. Durante questo periodo, la soluzione dovrebbe cambiare colore da giallo a rosa mentre il gel si solidifica. Trattare le cellule di fibroblasto umano con tripsina al 0,25% EDTA dal loro flacone di coltura dopo cinque minuti. Aggiungere DMEM contenente il 10% di FBS per neutralizzare il processo di dissociazione.

Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione per cinque minuti a 200 ×g a temperatura ambiente, quindi risospendere le cellule a 4,5 volte 10 alla quinta cellule per 1,5 millilitri di DMEM integrato con 10% FBS. Successivamente, riempire un tubo da 50 millilitri con la miscela di collagene del monostrato cellulare precedentemente preparata e porre il tubo sul ghiaccio.

Aggiungere 1,5 millilitri della sospensione di fibroblasti al tubo e mescolare accuratamente. Aggiungere tre millilitri della soluzione dello strato cellulare giallo paglierino a ciascun inserto rivestito con strato acellulare. Quindi incubare la piastra per colture tessutali per 45 minuti a 37 gradi Celsius in un'incubatrice per colture cellulari con 5% di anidride carbonica durante il periodo di incubazione.

Il colore della soluzione dello strato cellulare dovrebbe inoltre cambiare dal giallo al rosa. Una volta che il gel dello strato superiore si è solidificato, aggiungere due millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS all'interno dell'inserzione nella piastra per colture tessutali e dieci millilitri all'esterno dell'inserzione. Incubare le piastre per colture tessutali per quattro giorni.

Il quarto giorno verificare che il gel si sia contratto: aspirare il mezzo sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto. Aggiungere due millilitri di mezzo di lavaggio all'interno e 10 millilitri all'esterno degli inserti per rimuovere il siero normale. Quindi incubare le piastre per un'ora a 37 gradi Celsius per la formazione dell'epidermide.

Prima si tratta con tripsina i cheratinociti umani. Dopo cinque minuti, si utilizza l'inibitore della tripsina da soia per neutralizzare la tripsina, dopo aver centrifugato le cellule staccate a 200 G per cinque minuti. Successivamente, si risospende il pellet cellulare a una concentrazione di 4,17 × 10⁶ cellule per millilitro nella cute.

Ricostruire il mezzo dopo aver raccolto i cheratinociti. Incubare i melanociti umani con tripsina ghiacciata per uno o due minuti. Nuovamente, neutralizzare la tripsina con l'inibitore della tripsina da soia.

Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule nelle stesse condizioni di prima, risospendere il pellet di melanociti a 8,3 × 10⁵ cellule per millilitro in mezzo di ricostruzione cutanea uno. Successivamente, rimuovere il mezzo di lavaggio sia dall'interno che dall'esterno di ciascun inserto di una piastra per colture tessutali con strato dermico preparato.

Sostituire il mezzo di lavaggio aggiungendo 1,5 millilitri di mezzo per ricostruzione della pelle, uno all'interno e 10 millilitri all'esterno di ogni inserto. Successivamente, mescolare 600 microlitri della sospensione cellulare di cheratinociti con 600 microlitri della sospensione di melanociti. Distribuire 200 microlitri della sospensione cellulare mista.

Goccia a goccia all'interno di ogni inserto. Incubare la piastra per colture cellulari per due giorni a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione delle cellule, aspirare il mezzo di ricostruzione della pelle uno sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto, quindi aggiungere due millilitri di mezzo di ricostruzione della pelle due all'interno e 10 millilitri all'esterno dell'inserto.

Quindi incubare i ricostrutti per altri due giorni a 37 gradi celsius. Dopo la seconda incubazione di due giorni, aspirare il mezzo per ricostruzione della pelle, mezzo due, sia dall'interno che dall'esterno di ogni inserto. Aggiungere ora 7,5 millilitri del mezzo per ricostruzione della pelle, mezzo tre, soltanto all'esterno degli inserti.

Rimettere i ricostrutti nell'incubatore e sostituire il mezzo di coltura cutaneo ogni due giorni fino al giorno 18. Al giorno 18 dell'incubazione, aspirare il mezzo dall'interno e dall'esterno degli inserti di un vassoio per colture cellulari con ricostrutto cutaneo.

Rimuovere gli inserti dal vassoio con una pinzetta. Ritagliare la costruzione inclusivo del filtro in policarbonato, tracciando un cerchio vicino al bordo con una lama da bisturi. Quindi posizionare la ricostruzione sul filtro su una superficie rigida e tagliarla a metà con la lama.

Posizionare una metà del ricostruito su un foglio di carta per biopsia TBS nera, quindi inserire il foglio in una cassetta per istologia. Immergere l'intera cassetta in formalina al 10% per più di quattro ore. Successivamente, posizionare la cassetta nell'etanolo al 70% e conservarla a quattro gradi Celsius fino al momento di processare il ricostruito per l'inclusione in paraffina.

Posizionare l'altra metà del campione in saccarosio al 50% a quattro gradi Celsius per uno o due ore. Successivamente, sostituire il saccarosio con una soluzione due molare e conservare a quattro gradi Celsius per altre uno o due ore. Riempire a metà uno stampo di base con ottimo mezzo di taglio, mezzo criogenico o OCT.

Evitare la formazione di bolle. Afferrare il bordo del ricostrutto con una pinzetta ed estrarlo dal saccarosio. Posizionarlo su salviette Kim fino a quando il saccarosio non viene assorbito.

Utilizzando pinzette e una spatola, trasferire il ricostrutto nella barchetta sopra l'OCT. Coprire la parte superiore del ricostrutto con altro OCT fino a quando la barchetta non sarà completamente piena. Ancora una volta, evitando bolle d'aria.

Posizionare la barchetta uniformemente su ghiaccio secco tritato per consentire al OCT di congelarsi completamente. Quindi avvolgere lo stampo di base e la pellicola e conservarlo a meno 70 gradi Celsius fino al momento di tagliarlo con un criostato. Per prepararsi al trapianto di una ricostruzione cutanea su un topo, riempire un contenitore con azoto liquido e aggiungere cinque millilitri di DMEM in un tubo da 50 millilitri.

Riempire un becher con 600 millilitri di acqua del rubinetto e posizionare il becher su un piastra riscaldante per riscaldarlo. Quindi selezionare un topo femmina senza pelo, outbred, di circa sei settimane di età. Dopo aver anestetizzato il topo con isoflurano.

Utilizzare un cono nasale per mantenere l'anestesia durante tutta la procedura. Applicare un lubrificante oftalmico sterile e fornire un supporto termico per prevenire l'ipotermia. Successivamente, pulire la pelle del mouse con tintura di benzoino composta e salviette imbevute di alcol.

Tracciare una linea sulla parte superiore della schiena del topo per mantenere la stessa posizione durante la successiva sutura. Creare un letto della ferita di forma rotonda sulla schiena del topo utilizzando forbici da iridectomia e pinzette, quindi coprire il letto della ferita con garze sterili. Posizionare il campione rotondare di pelle del topo nel tubo da 50 millilitri contenente DMEM.

Immergere il tubo in un contenitore di azoto liquido fino a quando tutto il mezzo e il tessuto non saranno completamente congelati. Successivamente, scongelare il tubo in un bicchiere di acqua calda fino a completo scongelamento. Ripetere questa procedura di congelamento e scongelamento per tre volte.

Utilizzare una lama chirurgica per staccare un ricostrutto cutaneo da un inserto. Rimuovere con grande attenzione la membrana e quindi trasferire il ricostrutto cutaneo sulla superficie del letto della ferita del topo. Posizionare ora la pelle del topo sopra il ricostrutto cutaneo.

Assicurarsi che la prima sutura sia posizionata sopra il marcatore precedentemente etichettato e che la seconda sia in basso. Quindi utilizzare altre due suture ai lati della ricostruzione cutanea per fissare la pelle del topo. Pulire la pelle del topo dopo il trapianto, quindi collocare il topo in una nuova gabbia.

Al giorno 18. L'epidermide dei ricostrutti cutanei è composta da strati stratificati di cheratinociti, lo strato basale indifferenziato e gli strati successivamente differenziati sono orientati verticalmente. Colorazione della sezione dei ricostrutti con il marcatore melanocitico.

S 100, indicato dalle frecce nere, mostra che i melanociti sono allineati nel livello basale dell'epidermide e comunicano con numerosi cheratinociti attraverso estensioni dendritiche. Il compartimento dermico contiene fibroblasti immersi in una matrice di collagene di tipo uno; il collagene di tipo quattro indica la membrana basale, che separa l'epidermide dal derma. Le figure seguenti illustrano come si sviluppano i diversi strati di cheratinociti nell'epidermide.

Quando cellule staminali dermiche marcate con un vettore lentivirale GFP vengono incorporate insieme a fibroblasti in una matrice di collagene di tipo uno, esse migrano verso l'epidermide e si differenziano in melanociti al quinto giorno. Dopo la semina dei cheratinociti, singole cellule iniziano a migrare fuori dalle sfere.

Si noti che l'epidermide è ancora composta da un singolo strato. All'ottavo giorno, alcune cellule raggiungono l'interfaccia tra epidermide e derma.

Al giorno 10, le cellule positive per GFP sono strettamente allineate alla posizione della membrana basale, come si può osservare qui. Le cellule positive per GFP migrate nell'epidermide esprimono il marcatore melanocitico HMB 45. Quando linee cellulari di melanoma a diversi stadi vengono incorporate in ricostrutti cutanei, il comportamento delle cellule riflette le loro caratteristiche in vivo.

Qui, melanociti normali e cellule di melanoma coltivate in colture bidimensionali possono essere osservati in questa figura. La localizzazione e il tasso di crescita dei melanociti normali sono strettamente controllati nei ricostrutti cutanei, come mostrato qui; i melanomi primari in fase di crescita radiale proliferano principalmente nell'epidermide, mentre i melanomi in fase di crescita verticale crescono in modo invasivo nel derma, come visibile in questa figura. Infine, si può osservare qui il modo in cui i melanomi metastatici invadono aggressivamente in profondità nel derma.

I nostri studi sulla pelle normale forniscono le basi per una migliore comprensione dello sviluppo e della progressione del melanoma.