Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

L'obiettivo generale di questa procedura è generare una ricostruzione 3D della pelle umana per studi di melanociti, melanoma e biologia delle cellule staminali della pelle. Ciò si ottiene rivestendo prima un inserto di vassoi di coltura tissutale con collagene bovino neutralizzato. Il secondo passo è quello di creare il compartimento dermico cellulare da fibroblasti e collagene.

Successivamente, crea il compartimento epidermico da cheratinociti mescolati con melanociti o cellule di melanoma. La fase finale della procedura consiste nel prelevare una ricostruzione cutanea al giorno 18 e nell'innestare una ricostruzione cutanea su un topo. In definitiva, le analisi immunoistochimiche e immunofluorescenti del trapianto mostrano l'architettura della pelle normale contenente melanociti, la migrazione e la differenziazione delle cellule staminali normali e i fenotipi di melanoma specifici dello stadio.

Abbiamo sviluppato il modello di ricostruzione della pelle 20 anni fa perché all'inizio dei nostri studi abbiamo scoperto che i melanociti normali o le cellule di melanoma che vengono coltivate su un piatto si comportano in modo molto diverso dalle cellule che si trovano in un contesto tissutale. Quindi il modello di ricostruzione della pelle è l'ideale per noi per vedere come le cellule si spostano da un compartimento della pelle a qualsiasi altro luogo. Lo strato acellulare precedentemente preparato miscela di collagene su ghiaccio, e quindi aggiungere un millilitro della soluzione giallo paglierino in ciascun inserto di un sei.

Bene Vassoio per coltura tissutale Incubare il vassoio per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire al gel di solidificarsi. Durante questo periodo, la soluzione dovrebbe cambiare colore dal giallo al rosa mentre il gel sta solidificando gli occhi di tripsina, la fibra umana dalla loro fiaschetta di coltura con lo 0,25% di tripsina EDTA dopo cinque minuti. Aggiungere DMEM contenente il 10% di FBS per neutralizzare il processo di polarizzazione.

Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione per cinque minuti a 200 G a temperatura ambiente, quindi risospendere le cellule a 4,5 volte 10 fino alla quinta cella per 1,5 millilitri. DMEM integrato con il 10% di FBS. Successivamente, riempire una provetta da 50 millilitri con la miscela di collagene dello strato cellulare precedentemente preparata e posizionare la provetta sul ghiaccio.

Aggiungere 1,5 millilitri di sospensione di fibroblasti al tubo e mescolare. Aggiungere tre millilitri della soluzione di strato cellulare giallo paglierino a ciascun inserto rivestito di strato acellulare. Quindi, incubare il vassoio di coltura tissutale per 45 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di coltura tissutale al 5% di anidride carbonica durante il periodo di incubazione.

Anche il colore della soluzione dello strato cellulare dovrebbe cambiare dal giallo al rosa. Dopo che il gel dello strato superiore si è solidificato, aggiungere due millilitri di DMEM contenente il 10% di FBS all'interno dell'inserto nel vassoio di coltura tissutale e 10 millilitri all'esterno dell'inserto. Incubare i vassoi di coltura tissutale per quattro giorni.

Controllando il quarto giorno che il gel si contragga il quarto giorno di incubazione, aspirare il terreno sia dall'interno che dall'esterno di ciascun inserto. Aggiungere due millilitri di terreno di lavaggio all'interno e 10 millilitri all'esterno degli inserti per lavare via il siero normale. Quindi incubare i vassoi per un'ora a 37 gradi Celsius per la generazione dell'epidermide.

La prima tripsina è costituita dai cheratinociti umani. Quindi, dopo cinque minuti, utilizzare l'inibitore della tripsina di soia per neutralizzare la tripsina dopo aver centrifugato le cellule staccate a 200 g per cinque minuti. Reus sospende il pellet cellulare a 4,17 volte 10 per le sei cellule per millilitro nella pelle.

Ricostruire il terreno uno dopo che i cheratinociti sono stati raccolti. La tripsina ghiaccia i melanociti umani per uno o due minuti. Ancora una volta, neutralizzare la tripsina con un inibitore della tripsina di soia.

Quindi, dopo aver fatto girare le cellule nelle stesse condizioni di prima, risospendere il pellet di melanociti a 8,3 volte 10 al quinto cellulare per millilitro nella pelle. Ricostruisci anche quello medio. Quindi, rimuovere il terreno di lavaggio sia dall'interno che dall'esterno di ciascun inserto di un vassoio di coltura tissutale preparato con strato dermico.

Sostituire il mezzo di lavaggio aggiungendo 1,5 millilitri di pelle, terreno di ricostruzione, uno all'interno e 10 millilitri all'esterno di ciascun inserto. Quindi mescolare 600 microlitri di sospensione cellulare dei cheratinociti con 600 microlitri di sospensione di melanociti. Erogare 200 microlitri di sospensione cellulare mista.

Goccia a goccia all'interno di ogni inserto. Incubare il vassoio di coltura tissutale per due giorni a 37 gradi Celsius. Dopo aver incubato le cellule, aspirare la pelle, ricostruire il terreno sia dall'interno che dall'esterno di ciascun inserto, quindi aggiungere due millilitri di pelle, ricostruire il terreno, due all'interno e 10 millilitri all'esterno dell'inserto.

Quindi incubare le ricostruzioni per altri due giorni a 37 gradi Celsius. Dopo la seconda incubazione di due giorni, aspirare la pelle, ricostruire il terreno due dall'interno e dall'esterno di ciascun inserto. Ora aggiungi 7,5 millilitri di pelle, ricostruisci il terreno tre solo all'esterno degli inserti.

Rimetti i ricostruiti nell'incubatrice e cambia la pelle. Ricostruisci il mezzo tre a giorni alterni fino al giorno 18. Il giorno 18 dell'incubazione, aspirare il terreno dall'interno e dall'esterno degli inserti di un vassoio di coltura tissutale caricato per ricostruzione cutanea.

Rimuovere gli inserti dal vassoio con una pinza. Ritaglia il costrutto compreso il filtro in policarbonato tracciando un cerchio vicino al bordo con una lama di bisturi. Quindi posizionare i reconstruct nel filtro su una superficie dura e tagliarli a metà con la lama.

Posizionare una metà della ricostruzione su una carta nera per biopsia TBS, quindi posizionare la carta in una cassetta istologica. Immergere l'intera cassetta in formalina al 10% per più di quattro ore. Quindi posizionare la cassetta in etanolo al 70% e conservarla a quattro gradi Celsius fino a quando non si è pronti per elaborare la ricostruzione per l'inclusione in paraffina.

Posizionare l'altra metà del ricostruiscimento in saccarosio al 50% a quattro gradi Celsius per una o due ore. Quindi cambia il saccarosio in due molari e poi conservalo a quattro gradi Celsius per altre una o due ore. Riempire a metà uno stampo di base con la temperatura di taglio ottimale, il materiale di congelamento o l'OCT.

Evita le bolle. Afferrare il bordo della ricostruzione con una pinza e rimuovere la ricostruzione dal saccarosio. Mettilo sulle salviette Kim fino a quando il saccarosio non viene assorbito.

Usando una pinza e una spatola, trasferisci il reconstruct nella barca sopra l'OCT. Copri la parte superiore del reconstruct con altro OCT fino a quando la barca non è completamente piena. Ancora una volta, evitando le bolle.

Posizionare la barca in modo uniforme su ghiaccio secco tritato per consentire all'OCT di congelarsi completamente. Quindi avvolgere lo stampo di base e la pellicola e conservarlo a meno 70 gradi Celsius fino a quando non si è pronti per tagliarlo con un criostato. Per prepararsi all'innesto di una ricostruzione cutanea su un topo, riempire un contenitore con azoto liquido e aggiungere cinque millilitri di DMEM in un tubo da 50 millilitri.

Riempi un bicchiere con 600 millilitri di acqua del rubinetto e posizionalo sopra una piastra calda per scaldarlo. Quindi seleziona una femmina di topo di razza senza pelo di circa sei settimane di età. Dopo aver anestetizzato il topo con fluoro.

Utilizzare un cono nasale per mantenere l'anestesia durante la procedura. Applicare lubrificante oftalmico sterile e fornire supporto termico per prevenire l'ipotermia. Quindi, pulisci la pelle del topo con tintura di benzoino composta e tamponi per la preparazione dell'alcol.

Segna una linea sulla parte superiore del dorso del mouse per mantenere la stessa posizione per la sutura successiva. Taglia un letto di ferita rotondo sul dorso del mouse usando le forbici dell'iride e una pinza, quindi copri il letto della ferita con spugne di garza sterili. Metti la pelle rotonda del topo nel tubo da 50 millilitri di DMEM.

Immergere la provetta in un contenitore di azoto liquido fino a quando tutto il terreno e il tessuto non sono completamente congelati. Quindi, scongelare il tubo in un bicchiere di acqua calda fino a scongelarlo completamente. Ripetere questa procedura, congelare e scongelare tre volte.

Utilizzare una lama chirurgica per staccare una ricostruzione cutanea da un inserto. Rimuovere la membrana con molta attenzione e quindi trasferire la ricostruzione cutanea sulla parte superiore del letto della ferita del topo. Ora, posiziona la pelle del mouse sopra la pelle ricostruisci.

Assicurarsi che la prima sutura sia sopra il marcatore precedentemente etichettato e che la seconda sia sul fondo. Quindi utilizzare altre due suture sui lati della pelle per riparare la pelle del topo. Pulisci la pelle del topo dopo l'innesto, quindi metti il topo in una nuova gabbia.

Al giorno 18. L'epidermide della pelle ricostruita è composta da strati stratificati di cheratinociti, lo strato basale indifferenziato e gli strati differenziati in sequenza sono orientati verticalmente. Colorazione della sezione di ricostruzioni con il marcatore melanocitico.

S 100, come indicato dalle frecce nere, mostra che i melanociti sono allineati nello strato basale dell'epidermide e comunicano con più cheratinociti attraverso estensioni dendritiche. Il compartimento dermico contiene fibroblasti incorporati in una matrice di collagene di tipo uno depositato il collagene quattro indica la membrana basale, che separa l'epidermide dal derma. Le figure seguenti illustrano come si sviluppano più strati di cheratinociti nell'epidermide.

Quando le cellule staminali dermiche marcate con un vettore lentivirale GFP sono incorporate con fibroblasti. In una matrice di collagene di tipo uno, migrano verso l'epidermide e si differenziano in melanociti al quinto giorno. Dopo aver seminato i cheratinociti, le singole cellule iniziano a migrare fuori dalle sfere.

Si noti che l'epidermide è ancora composta da un unico strato. All'ottavo giorno. Alcune cellule raggiungono l'interfaccia epidermide-derma.

Entro il giorno 10 le cellule GFP positive sono strettamente allineate nella posizione della membrana basale, come si può vedere qui. Le cellule GFP positive migrate nell'epidermide esprimono il marcatore melanocitico HMB 45. Quando diversi stadi di linee cellulari di melanoma vengono incorporati nelle ricostruzioni cutanee, il comportamento delle cellule riflette le loro caratteristiche in vivo.

Qui, in questa figura si possono vedere melanociti normali e cellule di melanoma cresciute in colture 2D. La posizione e il tasso di crescita dei melanociti normali sono strettamente controllati nelle ricostruzioni cutanee come si vede qui, nella fase di crescita radiale, i melanomi primari proliferano prevalentemente nell'epidermide, mentre i melanomi in fase di crescita verticale crescono in modo invasivo nel derma come si vede in questa figura. Infine, qui si può vedere il modo in cui i melanomi metastatici invadono aggressivamente il derma.

I nostri studi sulla pelle normale forniscono le basi per una migliore conoscenza dello sviluppo e della progressione del melanoma.