Name: Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Scopri un metodo di screening ad alto rendimento per l'attività endoglucanasica fungina in Escherichia coli. Utilizza il colorante Congo Red per visualizzare la degradazione del substrato senza purificazione enzimatica.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Gordon and Betty Moore Foundation, e dal UNCF / Merck Iniziativa Scienza.

1. Screening piastra preparazione <ol><li> Aggiungere 25g terreno di coltura LB, agar 15g, e 1,5 g carbossimetil cellulosa (CMC) substrato di 1L di acqua distillata, e autoclave per la sterilizzazione. </li><li> Dopo la sterilizzazione in autoclave, permette raffreddare e aggiungere antibiotici appropriati, e IPTG ad una concentrazione finale di 100μM. </li><li> Versare 200 mL in media ogni 5 piatti grandi Petri piazza / vassoi biologico (240 x 240 x 20mm o più grandi). Lasciare le piastre ad asciugare completamente. </li></ol> 2. Endoglucanase generazione biblioteca e schermo <ol><li> Generare una libreria di endoglucanase dominio catalitico (s). Questo può essere ottenuto in molti modi (ad esempio, sito-diretta o mutagenesi casuale, ricombinazione, ecc) ed è determinato dal ricercatore. </li><li> Clonare la biblioteca in un vettore tale che essi sono sotto il controllo del promotore T7 con l'operatore lac, e contengono una sequenza pelB segnale per il targeting al periplasma. Un esempio di un vettore adatto è pET22b (+) da Novagen. </li><li> Trasformare la biblioteca in endoglucanase E. coli ceppo BL21 (DE3) e la piastra per singole colonie. </li><li> Incubare trasformazione durante la notte a 37 ° C. </li><li> Utilizzando stuzzicadenti sterile, inoculare cloni in 96 pozzetti profondi pozzetti contenenti medio 400μL LB integrato con antibiotici appropriati. Incubare a 37 ° C per una notte in agitazione a 250 rpm. </li><li> Aggiungere glicerolo sterile a 96 culture e durante la notte per una concentrazione finale del 10% per la conservazione a lungo termine a -80 ° C. Questo sarà il piatto principale. </li><li> Utilizzando un 96-pin bollo, replicare culture piatto durante la notte sulle piastre di screening contenenti IPTG e CMC. Fino a 5 gruppi di culture durante la notte può essere stampato su ogni piatto di screening. </li><li> Etichetta le piastre di screening in modo che l'identità e l'orientamento di ogni piastra 96 ​​pozzetti è noto. </li><li> Incubare le librerie timbrato a temperatura ambiente (17-25 ° C) durante la notte o fino a quando si sono formate colonie visibili. </li><li> Risciacquare con acqua distillata piatto fino a quando tutte le tracce delle colonie sono stati rimossi. </li><li> Versare Congo Red (CR; 0,5% in acqua) sulla piastra lavato. Assicurarsi di aggiungere quel tanto che basta CR per coprire la piastra. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. Non superare i 15 minuti per l'incubazione CR. Tempi di incubazione più lungo si tradurrà in aloni meno distinte. </li><li> Eliminare CR e aggiungere una generosa quantità (più che sufficienti a coprire il piatto) di NaCl 1M. </li><li> Incubare 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare NaCl per rivelare aloni degrado CMC. Per una migliore risoluzione delle aureole, tempi di incubazione più lungo con lavaggi NaCl NaCl o multipli possono essere richiesti. </li><li> Utilizzando uno stuzzicadenti sterile, pick attivo cloni enzimi dalla lastra per la ulteriore caratterizzazione. </li></ol> 3. Rappresentante dei risultati: Un esempio di lettura di questo schermo ad alto rendimento è mostrata in Figura 3. I cloni possono essere identificati come inattivo, debolmente attiva e molto attivi in ​​base alle dimensioni delle zone di degrado. Questo è particolarmente utile se un enzima ad attività nota è incluso nella biblioteca come riferimento. Come mostrato qui, l'identificazione degli enzimi attivi è robusta e riproducibile. Tuttavia, tieni presente che un'adeguata etichettatura delle lastre di screening è estremamente importante. Il ricercatore deve essere in grado di identificare le varianti attivo dopo aver lavato le colonie di distanza, al fine di raccoglierli dal piatto principale conservato a -80 ° C per un'ulteriore caratterizzazione. Infine, è difficile valutare a priori il rapporto tra le attività su substrati artificiali vs naturale. Pertanto, il ricercatore deve verificare tutti i cloni positivi su materiali di interesse industriale per determinare l'idoneità fisica proteine. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura 1. Delineare schematica della procedura di screening. Le cellule sono trasformate con una libreria endoglucanase e placcato selettivamente per singole colonie. Cloni raccolto e cresciuto durante la notte in 96 pozzetti pozzo profondo per (1) conservazione a -80 ° C e (2) placcatura replica su piastre contenenti CMC e IPTG per indurre l'espressione endoglucanase. Cloni attive vengono prelevati dalla piastra principale conservato a -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig2.jpg" alt="Figura 2"> Figura 2. Clonazione ed espressione di funghi domini catalitici in E. coli. (A) vettore di espressione Endoglucanase. I geni sono stati clonati in pET22b (+) (Novagen) sotto il controllo del promotore T7. (B) pannello di destra: endoglucanase che esprimono BL21 (DE3) colonie. Pannello di sinistra: aloni degrado CMC dopo il lavaggio e lo sviluppo con Rosso Congo. <img src="/files/ftp_upload/2942/2942fig3.jpg" alt="Figura 3"> Figura 3. I risultati dei campioni da CMC / Congo schermo Rosso. Foto scattate delle lastre di screening dopo il lavaggio e lo sviluppo del Congo Rosso. Tutte le colonie su spiatti creening erano di dimensioni simili.

<ol><li>Atsumi, S., Hanai, T., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-fermentative+pathways+for+synthesis+of+branched-chain+higher+alcohols+as+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels.</a> Nature. 451, 86-89 (2008).</li>
<li>Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulases+and+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cellulases and biofuels.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 295-299 (2009).</li>
<li>Qin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+endoglucanase+II+from+Trichoderma+reesei+to+improve+the+catalytic+efficiency+at+a+higher+pH+optimum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering endoglucanase II from Trichoderma reesei to improve the catalytic efficiency at a higher pH optimum.</a> J Biotechnol. 135, 190-195 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+endoglucanase+III+%28Cel12A%29+from+Trichoderma+reesei%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of endoglucanase III (Cel12A) from Trichoderma reesei.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 83, 649-657 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+family+of+thermostable+fungal+cellulases+created+by+structure-guided+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A family of thermostable fungal cellulases created by structure-guided recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 106, 5610-5615 (2009).</li>
<li>Heinzelman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCHEMA+recombination+of+a+fungal+cellulase+uncovers+a+single+mutation+that+contributes+markedly+to+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">SCHEMA recombination of a fungal cellulase uncovers a single mutation that contributes markedly to stability.</a> J Biol Chem. 284, 26229-26233 (2009).</li>
<li>Lantz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypocrea+jecorina+CEL6A+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Hypocrea jecorina CEL6A protein engineering.</a> Biotechnol Biofuels. 8, 3-20 (2010).</li>
<li>Mahadevan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+and+CBM+engineering+of+Cel5A+%28Thermotoga+maritima%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis and CBM engineering of Cel5A (Thermotoga maritima).</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 205-211 (2008).</li>
<li>Nakazawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+catalytic+domains+of+Trichoderma+reesei+endoglucanase+I%2C+II%2C+and+III%2C+expressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the catalytic domains of Trichoderma reesei endoglucanase I, II, and III, expressed in Escherichia coli.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 81, 681-689 (2008).</li>
<li>Wang, H., Jones, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+Macrophomina+phaseolina+endoglucanase+%28EGL+1%29+gene+product+in+bacterial+and+yeast+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Properties of the Macrophomina phaseolina endoglucanase (EGL 1) gene product in bacterial and yeast expression systems.</a> Appl Biochem Biotechnol. 81, 153-160 (1999).</li>
<li>Howard, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+activity+of+a+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+%28CBHI.1%29+expressed+as+a+heterologous+protein+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme activity of a Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase (CBHI.1) expressed as a heterologous protein from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 2, 296-300 (2003).</li>
<li>Howard, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+a+chimeric+Phanerochaete+chrysosporium+cellobiohydrolase+expressed+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Afr+J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of a chimeric Phanerochaete chrysosporium cellobiohydrolase expressed from Escherichia coli.</a> Afr J Biotechnol. 3, 349-352 (2004).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Env+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl Env Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Gilkes, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+and+substrate+specificities+of+cellulases+from+cloned+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Mode of action and substrate specificities of cellulases from cloned bacterial genes.</a> J Bio Chem. 259, 10455-10459 (1984).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo qui descritto consente una rapida identificazione e ad alta velocità di enzimi attivi, con la manipolazione minima. Rilevamento di attività è abbastanza sensibile, e riflette qualitativamente la quantità di attività all&#39;interno della cellula. La sua facilità d&#39;uso rende questo metodo adatto per una vasta gamma di librerie enzima, limitato solo dalla espressione funzionale in E. coli. Inoltre, lo screening attività di questo genere non è limitato a cellulasi fungine, ma può essere adattato ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Azienda </th><th> Prodotto numero </th></tr><tr><td> IPTG </td><td> Sigma </td><td> I1284 </td></tr><tr><td> Rosso Congo </td><td> Sigma </td><td> C6277 </td></tr><tr><td> Carbossimetilcellulosa </td><td> Sigma </td><td> 360384 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S1679 </td></tr><tr><td> Bacto-agar </td><td> BD Biosciences </td><td> 214030 </td></tr><tr><td> Bioassay piastre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 240845 </td></tr></tbody></table>

throughput screening elevati di attività endoglucanase fungine in escherichia coli</em

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulasi enzimi (endoglucanases, cellobiohydrolases e β-glucosidasi) idrolizzare cellulosa in zuccheri componente, che a sua volta può essere convertito in alcol carburante 1. Il potenziale per idrolisi enzimatica di biomasse cellulosiche per fornire energia rinnovabile ha intensificato gli sforzi per ingegnere cellulasi per 2 economiche di produzione di combustibile. Di particolare interesse sono cellulasi fungine 3-8, che sono già in uso industriale per i cibi e la lavorazione tessile. Identificare varianti attivo tra una libreria di cellulasi mutante è fondamentale per il processo di progettazione; mutanti attivo può essere ulteriormente testato per migliorare le proprietà e / o sottoposti a mutagenesi aggiuntivi. Ingegneria efficiente delle cellulasi fungine è stata ostacolata dalla mancanza di strumenti genetici per gli organismi nativi e dalla difficoltà di esprimere gli enzimi in ospiti eterologhi. Recentemente, Morikawa e collaboratori sviluppato un metodo per esprimere in E. coli i domini catalitici di endoglucanases da H. jecorina 3,9, un fungo importante industriale con la capacità di secernere cellulasi in grandi quantità. Funzionale E. espressione coli è stato anche segnalato per la cellulasi da altri funghi, compresi Macrophomina phaseolina 10 e Phanerochaete chrysosporium 11-12. Vi presentiamo un metodo per lo screening ad alto rendimento di attività endoglucanase fungine in E. coli. (Fig. 1) Questo metodo utilizza il comune microbica colorante Rosso Congo (CR) per visualizzare la degradazione enzimatica della carbossimetilcellulosa (CMC) di cellule in crescita su terreno solido. Il dosaggio attività richiede reagenti poco costosi, la manipolazione minima, e dà risultati inequivocabili come zone di degrado (&quot;aloni&quot;) sul sito colonia. Anche se una misura quantitativa di attività enzimatica non può essere determinato con questo metodo, abbiamo trovato che le dimensioni alone si correla con l&#39;attività enzimatica totale nella cella. Un&#39;ulteriore caratterizzazione dei singoli cloni positivi determinerà, fitness relativa proteina. Tradizionale batterica a cellule intere, CMC / CR saggi attività 13 coinvolgere versando CMC colonie su agar contenente, che è soggetto a contaminazione incrociata, o culture incubazione in pozzetti agar CMC, che è meno suscettibile di sperimentazione su larga scala. Qui riportiamo un protocollo che modifica migliorato i metodi esistenti lavare 14 per attività cellulasi: le cellule coltivate su piastre di agar CMC sono stati rimossi prima della colorazione CR. Il nostro protocollo riduce notevolmente la contaminazione crociata ed è altamente scalabile, permettendo un rapido screening di migliaia di cloni. Oltre ad H. enzimi jecorina, abbiamo espresso e proiettato varianti endoglucanase dal aurantiacus Thermoascus e Penicillium decumbens (Figura 2), suggerendo che questo protocollo è applicabile agli enzimi da una serie di organismi.

Descriviamo un basso costo, metodo elevato throughput per lo screening per l&#39;attività endoglucanase fungine in<em&gt; E. coli.</em&gt; Il metodo si basa su una semplice lettura visiva di degradazione del substrato, non necessita di purificazione degli enzimi, ed è altamente scalabile. Questo consente lo screening rapido di grandi biblioteche di varianti dell&#39;enzima.

Throughput Screening elevati di attività Endoglucanase fungine in Escherichia coli</em

Gli enzimi cellulasi (endoglucanasi, cellobioidrolasi e $\beta$-glucosidasi) idrolizzano la cellulosa in zuccheri componenti, i quali a loro volta possono essere convertiti...

In questo screening ad alto rendimento per l'attività di endo-glucanasi fungina in e coli, il colorante microbico comune Rosso Congo viene utilizzato per visualizzare la degradazione enzimatica della carbossimetilcellulosa da parte di cellule in crescita su mezzo solido. Inizialmente, le cellule vengono trasformate con una libreria di endo-glucanasi e piastrate selettivamente per ottenere singole colonie. Successivamente, singoli cloni vengono selezionati e coltivati per tutta la notte in piastre a 96 pozzetti. Quindi, viene effettuato uno screening enzimatico mediante replica plating su piastre con CMC contenenti IPTG per indurre l'espressione dell'endo-glucanasi.Infine, si prelevano i cloni dalla piastra master conservata a meno 80 gradi Celsius. Questo saggio produce risultati inequivocabili, con zone di degradazione visibili nel sito della colonia, dove la dimensione dell'alone è correlata all'attività enzimatica e consente una valutazione qualitativa dell'idoneità relativa della proteina. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo di sovrapposizione, è che permette un'analisi ad alto rendimento con un tasso di falsi positivi molto basso.Aggiungere 25 grammi di terreno di coltura LB, 15 grammi di agar e 1,5 grammi di substrato carbossimetilcellulosa a un litro di acqua distillata, quindi sterilizzare in autoclave. Dopo il raffreddamento del terreno, aggiungere antibiotici appropriati e IPTG fino a una concentrazione finale di 100 micromolari. Versare ora 200 millilitri di terreno ciascuno in cinque piastre di Petri quadrate grandi o vassoi per saggio biologico, e lasciare asciugare completamente le piastre.Per prima cosa, generare una libreria di domini catalitici endo gluconato in un vettore adatto come PET 22 B plus di Novagen. Per prima cosa, generare una libreria di domini catalitici endo gluconato in un vettore adatto come PET 22 B plus di Novagen che contiene il promotore T7 con un operatore lac e una sequenza segnale PAL LV per il targeting al periplasma. Trasformare la libreria di endo gluconato in ceppo di e coli BL 21 DE3 piastrando per ottenere singole colonie utilizzando perle di vetro e incubare la trasformazione tutta la notte a 37 gradi Celsius; inoculare le colonie in piastre 96 utilizzando stecchini sterili.Piastre a pozzetti profondi contenenti 400 microlitri di mezzo LB integrato con antibiotici appropriati. Incubare a 37 gradi Celsius durante la notte con agitazione a 250 giri al minuto. Aggiungere ora glicerolo sterile alle colture notturne in piastre a 96 pozzetti per la conservazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius.Questa sarà la piastra principale; utilizzando uno stampo a 96 pin, replicare le colture in fase di crescita notturna sulle piastre di screening contenenti IPTG e CMC per ciascuna piastra di screening. Stampare cinque set di colture notturne, etichettare e incubare a temperatura ambiente fino a quando si saranno formate colonie visibili. Proseguire risciacquando la piastra con acqua distillata fino a quando non saranno rimaste più tracce delle colonie.Versare una quantità appena sufficiente di rosso Congo allo 0,5% per coprire la piastra lavata e incubare per un massimo di 15 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il colorante con un eccesso di cloruro di sodio uno molare e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, eliminare il cloruro di sodio per rivelare gli aloni di degradazione del CMC.Utilizzando un bastoncino sterile, selezionare enzimi attivi dalla piastra principale per una caratterizzazione ulteriore. In questo esempio, vettori di espressione di endo gluconato sono stati generati in PET 22 B plus sotto il controllo del promotore T sette con un operatore lac. Le colonie di BL 21 esprimenti endo gluconato sono state quindi sottoposte a screening per produrre aloni di degradazione del CMC. Dopo il lavaggio e lo sviluppo con Rosso Congo, le colonie su queste piastre di screening possono essere solitamente identificate come inattive, debolmente attive e altamente attive in base alle dimensioni delle zone di degradazione.Qui, l'identificazione degli enzimi attivi è robusta e riproducibile. È importante ricordare di etichettare correttamente le piastre di screening per identificare in modo preciso le colonie positive nella piastra master.

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