Misure biochimiche di ipossia neonatale

Un metodo è descritto per misurare i marcatori biochimici di ischemia-ipossia neonatale. L'approccio utilizza cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia spettrometria di massa (GC / MS).

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare i marcatori biochimici dell'ischemia ipossica neonatale. Ciò si ottiene raccogliendo prima campioni di sangue dai neonati per isolare il plasma. Successivamente, una parte del plasma viene filtrata, combinata con uno standard interno e analizzata per le concentrazioni di ipossitina, santina e acido urico sull'HPLC due.

Altre aliquote plasmatiche vengono quindi elaborate in modo differenziale e analizzate separatamente. Per la concentrazione di allantoina e i livelli di MDA sul GCMS, la fase finale della procedura consiste nel combinare una porzione di plasma con un substrato per avviare la reazione enzimatica dopo aver estinto la reazione. L'attività della xanthe ossidasi può essere determinata su un'HPLC dotata di un rivelatore fluorescente.

Alla fine, si ottengono risultati che mostrano cromatogrammi delle aree di picco, che possono essere convertiti in concentrazioni molari dei marcatori biochimici desiderati o dell'attività enzimatica tramite curve standard. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi dell'ischemia da ipossia neonatale perché questo metodo combina le misurazioni dei marcatori di privazione energetica, stress ossidativo, danno ossidativo e attività enzimatica per generare un quadro biochimico complessivo della presenza e persino del grado di ischemia ipossica prima dell'inizio di questa procedura. Un campione di sangue umano viene raccolto da un neonato subito dopo la nascita in una provetta EDTA da sei millilitri in meno di cinque minuti.

Dopo la raccolta, centrifugare il campione a quattro gradi Celsius e 1.500 volte G per 10 minuti. Trasferire il plasma, che è presente nel supinato, in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare per 30 minuti. Rimuovere il supinato facendo attenzione a non contaminare i campioni con i globuli rossi.

Eloqua i campioni in provette separate per micro centri per l'analisi di purine, lanina, MDA e xanthe ossidasi per ogni misurazione PLC di purine. Trasferire 200 microlitri di plasma a un dispositivo di filtro centrifugo. Centrifugazione del plasma a quattro gradi Celsius e 14.000 volte G per 1,5 ore.

Rimuovere il filtrato e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga contenente due purine di aino. Assicurarsi di registrare il volume di filtrato aggiunto alla provetta da microcentrifuga contenente due AP.To determinare con precisione la concentrazione. Agitare il tubo per 10-20 secondi.

Analizzare i campioni con un HPLC come descritto nel protocollo scritto utilizzando tre iniezioni da 50 microlitri per ciascun campione dai cromatogrammi risultanti. Determinare la concentrazione di purine nel campione. Quantificare l'ipoxantina, la xantina e l'acido urico ottenendo aree di picco ai tempi di ritenzione e alle lunghezze d'onda corrispondenti.

Quindi, quantificare l'area del picco di due ap. Da queste informazioni, è possibile calcolare i rapporti di area dell'iperxantina e dell'acido urico rispetto a due AP. Quindi convertire i rapporti in concentrazioni micromolari utilizzando curve standard Per eseguire la misurazione della lanina, aggiungere 50 microlitri dello standard interno e 100 microlitri di nitrile aceto a 50 microlitri di plasma.

Dopo aver agitato la miscela per 10-20 secondi. Centrifugare per 10 minuti dopo la centrifugazione. Rimuovere il supinato e metterlo in un flaconcino GCM S.

Asciugare il liquido sotto azoto gassoso. Una volta che il liquido è asciutto, aggiungere 25 microlitri di agenti izzanti M-T-B-S-T-F-A e 25 microlitri di piridina. Tappare la fiala e incubarla a 50 gradi Celsius per due ore.

Quindi trasferire il campione in un'altra fiala GCMS con un inserto da 300 microlitri. Analizza i campioni sul GCMS utilizzando un campionatore automatico. Eseguire la separazione dei composti utilizzando l'elio come gas di trasporto con una portata di 1,5 millilitri al minuto.

Per iniziare l'analisi GCMS, immettere i parametri per l'esecuzione. Impostare la temperatura iniziale della colonna a 100 gradi Celsius e mantenerla per due minuti prima di aumentarla a 180 gradi Celsius a una velocità di 10 gradi Celsius al minuto. Mantieni la temperatura per quattro minuti, quindi aumentala a 260 gradi Celsius a una velocità di 20 gradi Celsius al minuto.

Mantenere questa temperatura fino alla fine della corsa. Utilizzare il campionatore automatico per iniettare un microlitro del prodotto DERIVATIZZATO in modalità split ed eseguire la corsa tra ogni campionamento. Far pulire la colonna dall'autocampionatore con due iniezioni di piridina M-T-B-S-T-F-A.

Per quantificare un LAN toin, si seleziona la modalità di monitoraggio ionico e si monitora il rapporto di carica master 3 98 per atlanto in e il rapporto di carica master 400 per l'atlanto in pesante. Quindi convertire i rapporti di abbondanza ionica di atlanto in atlanto pesante in concentrazioni micromolari di atlanto utilizzando una curva standard preparata prima della misurazione di MDA, preparare soluzioni di idrossilitotoluene butilico e 50 millimolari di fenilidrazina come descritto nel protocollo scritto. AGGIUNGERE M-M-D-A-B-H-T e citrato di sodio al campione di plasma da 100 microlitri.

Diluire la miscela finale a 480 microlitri aggiungendo acqua distillata deionizzata. Derivatizzare la soluzione aggiungendo 20 microlitri di fenolo idrazina 50 millimolare. Dopo aver tappato il flaconcino, incubare la soluzione su un agitatore orbitale.

Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di esano a vorticare la miscela per un minuto e centrifugare a 3000 giri al minuto per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, trasferire lo strato organico in una provetta da microcentrifuga. Quindi concentrare la soluzione a 100 microlitri evaporando sotto un flusso di azoto gassoso e trasferirla in un file A-G-C-M-S con un inserto da 300 microlitri.

Successivamente, analizzare i campioni su A-G-C-M-S utilizzando il campionatore automatico che esegue la separazione dei composti e la quantificazione dell'MDA come descritto nella procedura scritta. Iniziare il rilevamento dell'attività della santhe-ossidasi preparando due fiale per campioni di plasma. Uno da incubare con il substrato per zero minuti come controllo e uno da incubare per quattro ore.

Durante l'esperimento, aggiungere tampone e substrato a ciascuna provetta. Pre-incubare i campioni a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Avviare la reazione enzimatica aggiungendo 60 microlitri di plasma a ciascuna provetta.

Aggiungere immediatamente 300 microlitri di acido clorico al 4% alla provetta a incubazione zero. Al contrario, lasciare incubare l'altra miscela per quattro ore a 37 gradi Celsius prima di estinguere la reazione dopo l'aggiunta di acido clorico. Agitare la provetta di controllo dell'incubazione zero e proseguire con la centrifugazione.

Rimuovere 500 microlitri di supinato e aggiungerlo a una provetta contenente 20 microlitri di carbonato di potassio a cinque molari per neutralizzare il vortice di reazione, il campione neutralizzato e centrifugare per la seconda volta. Quindi aggiungere 350 microlitri della soluzione neutralizzata in una provetta per microcentrifuga contenente due ap. Dopo aver incubato il campione di quattro ore, spegnere la reazione aggiungendo 300 microlitri di acido clorico al 4%.

Continuare l'elaborazione del campione come per il campione di controllo. Analizza i campioni su un HPLC dotato di un rivelatore a fluorescenza a scansione. Inserire i parametri utilizzando le condizioni socratiche a una velocità di flusso di un millilitro al minuto.

Per ottenere un'adeguata separazione e identificazione dei picchi, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del rivelatore a fluorescenza a 340 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione di 410 nanometri a 30. Le iniezioni di microlitri vengono eseguite sull'HPLC per ogni campione successivo all'esecuzione dell'HPLC. Determinare il rapporto tra ISO terin e due AP ottenendo le aree di picco dallo spettro del rivelatore di fluorescenza.

Il primo picco nello spettro a circa cinque minuti corrisponde a due ap. La seconda e più grande vetta sarà terran. Il picco dell'antero-terina ISO eluisce per ultimo, ottenere la differenza nei rapporti ISO ANTOIN di due AP dell'area del picco tra i punti di tempo di incubazione zero e quattro ore.

Utilizzare questo valore per calcolare l'attività della xantina ossidasi dalle curve standard. Un esempio della quantificazione HPLC dei composti di purificazione è mostrato che i tempi di ritenzione specifici e le lunghezze d'onda di emissione dell'acido urico, dell'ipoxantina e della xantina consentono la quantificazione simultanea dei composti purinici. Quando il test viene eseguito correttamente, i composti avranno una separazione adeguata e la forma del picco sarà nitida e unimodale.

Se sono presenti bolle d'aria nel sistema HPLC, i tempi di ritenzione cambieranno e la pressione HPLC fluttuerà drasticamente. Se è necessario sostituire la cartuccia di protezione, la pressione aumenterà e i picchi si allargheranno e diventeranno di un trimodale o di un trimodale, come mostrato in questo esempio qui. Un esempio della quantificazione GCMS della lanina è mostrato perché è nota la lanina derivatizzata massiva e la lanina pesante derivatizzata.

La modalità di selezione ionica può essere utilizzata per identificare questi composti sullo spettrometro di massa. Se il test viene eseguito correttamente, si osserveranno due picchi allo stesso tempo di ritenzione. Una vetta corrisponde ad Alan Toin e l'altra al toin pesante.

I risultati per la quantificazione dell'MDA sono simili a quelli di Alan Toin, con l'eccezione che i due picchi si osservano in tempi di ritenzione diversi. Qui, si osserva un picco del rapporto di carica principale di 144 per l'MDA e un picco del rapporto di carica principale di 158 per l'MMDA. Un esempio di quantificazione basata su HPLC della funzione della xanthe ossidasi è dimostrato al tempo di incubazione al minuto zero e al tempo di incubazione di quattro ore.

Se il test viene eseguito correttamente, si dovrebbero osservare tre picchi con il rivelatore fluorescente, uno per due ap, uno per Terran e uno per ISO terin. Si noti che il picco della terina ISO più elevato per il tempo di incubazione di quattro ore è dovuto all'aumento dell'attività dell'enzima santhe ossidasi. Poiché questo test misura la funzione enzimatica, il congelamento e lo scongelamento ripetuti del campione possono alterare questa situazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare con precisione diversi marcatori biochimici dell'ischemia da ipossia neonatale.