Name: Misure biochimiche di ipossia neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Scopri come misurare marcatori biochimici di ipossia neonatale usando HPLC e GC/MS su campioni di plasma. Questo metodo analizza metaboliti come ipoxantina e acido urico per diagnosticare precocemente l'ischemia.

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<ol><li>Harkness, R. A., Whitelaw, A. G., Simmonds, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapartum+hypoxia%3A+the+association+between+neurological+assessment+of+damage+and+abnormal+excretion+of+ATP+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Intrapartum hypoxia: the association between neurological assessment of damage and abnormal excretion of ATP metabolites.</a> J Clin Pathol. 35, 999-1007 (1982).</li>
<li>Shalak, L., Perlman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxic-ischemic+brain+injury+in+the+term+infant-current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Early+Hum+Dev%22%5BJournal%5D)">Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant-current concepts.</a> Early Hum Dev. 80, 125-141 (2004).</li>
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<li>Choi, E. Y., Stockert, A. L., Leimkuhler, S., Hille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+mechanism+of+action+of+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase.</a> J Inorg Biochem. 98, 841-848 (2004).</li>
<li>Godber, B. L., Schwarz, G., Mendel, R. R., Lowe, D. J., Bray, R. C., Eisenthal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+human+xanthine+oxidoreductase%3A+the+enzyme+is+grossly+deficient+in+molybdenum+and+substantially+deficient+in+iron-sulphur+centres%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of human xanthine oxidoreductase: the enzyme is grossly deficient in molybdenum and substantially deficient in iron-sulphur centres.</a> Biochem J. 388, 501-508 (2005).</li>
<li>Gruber, J., Tang, S. Y., Jenner, A. M., Mudway, I., Blomberg, A., Behndig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allantoin+in+human+plasma%2C+serum%2C+and+nasal-lining+fluids+as+a+biomarker+of+oxidative+stress%3A+avoiding+artifacts+and+establishing+real+in+vivo+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Allantoin in human plasma, serum, and nasal-lining fluids as a biomarker of oxidative stress: avoiding artifacts and establishing real in vivo concentrations.</a> Antioxid Redox Signal. 11, 1767-1776 (2009).</li>
<li>Zitnanova, I., Korytar, P., Aruoma, O. I., Sustrova, M., Garaiova, I., Muchova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uric+acid+and+allantoin+levels+in+Down+syndrome%3A+antioxidant+and+oxidative+stress+mechanisms%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Uric acid and allantoin levels in Down syndrome: antioxidant and oxidative stress mechanisms?</a> Clin Chim Acta. 341, 139-146 (2004).</li>
<li>Siciarz, A., Weinberger, B., Witz, G., Hiatt, M., Hegyi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+thiobarbituric+acid-reacting+substances+as+potential+biomarkers+of+intrauterine+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pediatr+Adolesc+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary thiobarbituric acid-reacting substances as potential biomarkers of intrauterine hypoxia.</a> Arch Pediatr Adolesc Med. 155, 718-722 (2001).</li>
<li>Buonocore, G., Perrone, S., Longini, M., Terzuoli, L., Bracci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+hydroperoxide+and+advanced+oxidation+protein+products+in+preterm+hypoxic+babies%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Total hydroperoxide and advanced oxidation protein products in preterm hypoxic babies.</a> Pediatr Res. 47, 221-224 (2000).</li>
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<li>Harkness, R. A., Lund, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+hypoxanthine%2C+xanthine%2C+uridine+and+inosine%3A+high+concentrations+of+the+ATP+metabolite%2C+hypoxanthine%2C+after+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentrations of the ATP metabolite, hypoxanthine, after hypoxia.</a> J Clin Pathol. 36, 1-8 (1983).</li>
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<li>Cighetti, G., Allevi, P., Anastasia, L., Bortone, L., Paroni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+methyl+malondialdehyde+as+an+internal+standard+for+malondialdehyde+detection%3A+validation+by+isotope-dilution+gas+chromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of methyl malondialdehyde as an internal standard for malondialdehyde detection: validation by isotope-dilution gas chromatography-mass spectrometry.</a> Clin Chem. 48, 2266-2269 (2002).</li>
<li>Paroni, R., Fermo, I., Cighetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+methyl+malondialdehyde+as+internal+standard+for+malondialdehyde+detection+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validation of methyl malondialdehyde as internal standard for malondialdehyde detection by capillary electrophoresis.</a> Anal Biochem. 307, 92-98 (2002).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Ciuffreda, P., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-ethoxyacrolein+contamination+increases+malondialdehyde+inhibition+of+milk+xanthine+oxidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Beta-ethoxyacrolein contamination increases malondialdehyde inhibition of milk xanthine oxidase activity.</a> Free Radic Biol Med. 25, 818-825 (1998).</li>
<li>Cighetti, G., Debiasi, S., Paroni, R., Allevi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+and+total+malondialdehyde+assessment+in+biological+matrices+by+gas+chromatography-mass+spectrometry%3A+what+is+needed+for+an+accurate+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Free and total malondialdehyde assessment in biological matrices by gas chromatography-mass spectrometry: what is needed for an accurate detection.</a> Anal Biochem. 266, 222-229 (1999).</li>
<li>Yamamoto, T., Moriwaki, Y., Takahashi, S., Tsutsumi, Z., Yamakita, J., Nasako, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+human+plasma+xanthine+oxidase+activity+by+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Biomed+Appl%22%5BJournal%5D)">Determination of human plasma xanthine oxidase activity by high-performance liquid chromatography.</a> J Chromatogr B Biomed Appl. 681, 395-400 (1996).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Handbook+of+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22">Handbook of Biochemistry and Molecular Biology</a>. Fasman, G. , 3 ed, CRC Press. Boca Raton. (1988).</li>
<li>Chen, X. B., Calder, A. G., Prasitkusol, P., Kyle, D. J., Jayasuriya, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+15N+isotopic+enrichment+and+concentrations+of+allantoin+and+uric+acid+in+urine+by+gas+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Determination of 15N isotopic enrichment and concentrations of allantoin and uric acid in urine by gas chromatography/mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 33, 130-137 (1998).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi descritti permettono la valutazione di ischemia ipossia neonatale. Questo protocollo combina la misurazione dei marcatori di energia (ATP) privazione, stress ossidativo, danno ossidativo, l&#39;attività enzimatica e di avere una visione globale biochimiche della presenza o anche il grado di ipossia, ischemia. Nonostante l&#39;utilità di questo metodo, ci sono delle limitazioni potenziale. In primo luogo, ci vogliono circa 1-2 ml di sangue per la raccolta del plasma sufficiente per eseguire tutti i test. Questo ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Con 13 e adattatore 16MM </td></tr><tr><td> Microcentrifuga 1,5 ml tubo </td><td> USA scientifico </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 spettrofotometro </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositivo centrifugo filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Colonna </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartuccia e titolare </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Acque </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMS Vial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoina -13 C-5, 1 -15 N </td><td> CDN Isotopi </td><td> M-2307 </td><td> Lotto # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # 5975E per GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Etere diisopropile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenilidrazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

misure biochimiche di ipossia neonatale

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Ischemia ipossia neonatale è caratterizzata da inadeguata perfusione sanguigna di un tessuto o una carenza sistemica di ossigeno. Questa condizione è pensato per causare / esacerbare ben documentate patologie neonatali compresi danni neurologici 1-3. Diminuzione della produzione di adenosina trifosfato si verifica a causa della mancanza di fosforilazione ossidativa. Per compensare questo molecole di energia priva di stato contenenti legami fosfato ad alta energia sono 2 degradati. Questo porta ad aumento dei livelli di adenosina, che viene successivamente degradato a inosina, ipoxantina, xantina, e infine ad acido urico. Gli ultimi due passaggi di questo processo di degradazione sono eseguite da xantina ossidoreduttasi. Questo enzima esiste in forma di xantina deidrogenasi in condizioni di normossia ma viene convertito in xantina ossidasi (XO) con ipossia-riperfusione circostanze 4, 5. A differenza di xantina deidrogenasi, XO genera perossido di idrogeno come sottoprodotto della degradazione delle purine 4, 6. Questo perossido di idrogeno in combinazione con altre specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) prodotte durante l&#39;ipossia, ossida l&#39;acido urico ad allantoina forma e reagisce con le membrane lipidiche per generare malondialdeide (MDA) 7-9. Maggior parte dei mammiferi, esseri umani esentati, in possesso dei uricasi enzima, che converte l&#39;acido urico ad allantoina. Negli esseri umani, tuttavia, allantoina può essere formata da ROS-mediate l&#39;ossidazione dell&#39;acido urico. Per questo motivo, allantoina è considerato un marker di stress ossidativo nell&#39;uomo, ma non nei mammiferi che hanno uricasi. Descriviamo impiegando metodi ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia e spettrometria di massa (GCMS) per misurare i marcatori biochimici di ischemia ipossia neonatale. Il sangue umano è utilizzato per maggior parte dei test. Sangue animale può essere utilizzato anche, pur riconoscendo il potenziale di uricasi generati allantoina. Metaboliti purinici sono stati legati all&#39;ipossia già nel 1963 e l&#39;affidabilità di ipoxantina, xantina, acido urico e come indicatori biochimici di ipossia neonatale è stato validato da vari ricercatori 10-13. Il metodo HPLC utilizzato per la quantificazione dei composti purinici è veloce, affidabile e riproducibile. Il GC / MS metodo utilizzato per la quantificazione del allantoina, un marker relativamente nuovo di stress ossidativo, è stato adattato da Gruber et al 7. Questo metodo evita certi artefatti e richiede bassi volumi di campione. I metodi utilizzati per la sintesi di MMDA sono stati descritti in altri 14, 15. GC / MS quantificazione basato su MDA è stato adattato da Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina ossidasi è stata misurata mediante HPLC quantificando la conversione di pterina a isoxanthopterin 18. Questo approccio si è rivelato sufficientemente sensibile e riproducibile.

Un metodo è descritto per misurare i marcatori biochimici di ischemia-ipossia neonatale. L&#39;approccio utilizza cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia spettrometria di massa (GC / MS).

Misure biochimiche di ipossia neonatale

L'ipossia-ischemia neonatale è caratterizzata da un'insufficiente perfusione ematica di un tessuto o da una carenza sistemica di ossigeno. Si ritiene che questa condizione...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare i marcatori biochimici dell'ischemia ipossica neonatale. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo campioni di sangue da neonati per isolare il plasma. Successivamente, una parte del plasma viene filtrata, combinata con uno standard interno e analizzata per le concentrazioni di ipoxantina, santina e acido urico mediante HPLC due.Successivamente, aliquote di plasma vengono processate e analizzate separatamente in modo differenziale. Per la concentrazione di allantoina e i livelli di MDA mediante GCMS, l'ultimo passaggio della procedura consiste nell'unire una porzione di plasma a un substrato per avviare la reazione enzimatica dopo aver arrestato la reazione. L'attività della xantina ossidasi può essere determinata mediante HPLC dotato di un rivelatore fluorimetrico.In definitiva, si ottengono risultati che mostrano cromatogrammi di aree dei picchi, che possono essere convertiti in concentrazioni molari dei marcatori biochimici desiderati o dell'attività enzimatica mediante curve standard. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi dell'ipossia ischemica neonatale poiché questo metodo com

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Qui vi proponiamo semplici metodi per indurre ipossia in colture cellulari e semplici test per valutare lo stato di ipossia delle culture.

Induzione e test di ipossia in coltura cellulare

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Abbiamo combinato nel dominio della frequenza del vicino infrarosso misure di spettroscopia di ossigenazione dell'emoglobina cerebrale con misure di spettroscopia di correlazione di diffuse indice flusso ematico cerebrale per stimare un indice di metabolismo dell'ossigeno. Abbiamo testato l'utilità di questa misura come strumento di screening letto per valutare la salute e lo sviluppo del cervello neonato.

Non invasiva di misurazione ottica del metabolismo cerebrale ed emodinamica nei neonati

L'encefalopatia ipossico-ischemica a seguito di asfissia perinatale può essere studiata utilizzando modelli animali. Dimostriamo le procedure necessarie per stabilire un modello di suinetto di encefalopatia ipossico-ischemica neonatale.

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Questo articolo descrive la metodologia per la somministrazione di brevi periodi di ipossia intermittente per postnatali giorno 1-8 di topo o ratto cuccioli. Questo approccio suscita effettivamente un livello del tessuto robusto "effetto priming" su colture di cellule progenitrici neurali che vengono raccolte entro 30 minuti dall'esposizione ipossia.

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Il non anestetizzato modello pecore fetale cronicamente strumentato viene utilizzato per studiare lo sviluppo del feto umano in salute e malattia, perché permette l'inserimento chirurgico e manutenzione di cateteri ed elettrodi, ripetitivo prelievi di sangue, iniezione di sostanze, registrazione dell'attività bioelettrica, e imaging in vivo. Si descrivono le procedure necessarie per stabilire questo modello.

Strumentazione di A breve termine pecore fetale per multivariata cronica Recordings non anestetizzati

L'imaging microcircolatorio (MI) viene utilizzato per monitorare la perfusione periferica in neonati gravemente malati o pretermine. Questo manoscritto e video dimostrano l'approccio ottimale per ottenere immagini di alta qualità.

Transcutanea microcircolatoria Imaging in pretermine neonati

Questo protocollo è progettato per aiutare i medici a misurare l'ossigenazione dei tessuti regionali in diversi siti corporei nei neonati e nei bambini. Può essere utilizzato in situazioni in cui l'ossigenazione dei tessuti è potenzialmente compromessa, in particolare durante il bypass cardiopolmonare, quando si utilizzano dispositivi di assistenza cardiaca non pulsatile e in neonati, neonati e bambini gravemente malati.

Come somministrare la spettroscopia del vicino infrarosso in neonati, neonati e bambini gravemente malati

Presentiamo un protocollo per misurare la saturazione regionale di ossigeno (rSO2) nei pazienti in emodialisi (HD) utilizzando un monitor spettroscopico nel vicino infrarosso. Il valore rSO2 è un indice di ossigenazione dei tessuti. Questo monitoraggio non invasivo e in tempo reale potrebbe essere utile per confermare i cambiamenti nell'ossigenazione degli organi durante la MH.

Misura dell'ossigenazione tissutale mediante spettroscopia nel vicino infrarosso in pazienti sottoposti a emodialisi

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipossia nei topi neonatali somministrandoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I modelli murini sottoposti a variazioni di ossigeno alla nascita hanno variato durevolmente l'espressione dei miRNA coinvolti nell'induzione di cambiamenti fenotipici comportamentali come l'autismo.

L'ipossia altera i livelli di miRNA coinvolti nell'ereditarietà non mendeliana del disturbo dello spettro autistico nei topi

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