Name: Misure biochimiche di ipossia neonatale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: Scopri come misurare marcatori biochimici di ipossia neonatale usando HPLC e GC/MS su campioni di plasma. Questo metodo analizza metaboliti come ipoxantina e acido urico per diagnosticare precocemente l'ischemia.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi descritti permettono la valutazione di ischemia ipossia neonatale. Questo protocollo combina la misurazione dei marcatori di energia (ATP) privazione, stress ossidativo, danno ossidativo, l&#39;attività enzimatica e di avere una visione globale biochimiche della presenza o anche il grado di ipossia, ischemia. Nonostante l&#39;utilità di questo metodo, ci sono delle limitazioni potenziale. In primo luogo, ci vogliono circa 1-2 ml di sangue per la raccolta del plasma sufficiente per eseguire tutti i test. Questo ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> 6ml K3E EDTA K3 tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 2204061 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga 5702R </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05413319 </td><td> Con 13 e adattatore 16MM </td></tr><tr><td> Microcentrifuga 1,5 ml tubo </td><td> USA scientifico </td><td> 1615-5599 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminopurine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3509 </td><td></td></tr><tr><td> Varian Cary 100 spettrofotometro </td><td> Agilant Technologies </td><td> 0010071500 </td><td></td></tr><tr><td> Savant SpeedVac </td><td> Thermo Scientific </td><td> SC210A-115 </td><td></td></tr><tr><td> Micron dispositivo centrifugo filtro </td><td> Fisher Scientific </td><td> UFC501596 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Colonna </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 58931 </td><td></td></tr><tr><td> Supelcosil LC-18-S Supelguard cartuccia e titolare </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 59629 </td><td></td></tr><tr><td> HPLC </td><td> Acque </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GCMS Vial </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03376607 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Allantoina -13 C-5, 1 -15 N </td><td> CDN Isotopi </td><td> M-2307 </td><td> Lotto # L340P9 </td></tr><tr><td> MTBSTFA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 48920 </td><td></td></tr><tr><td> Piridina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270970 </td><td></td></tr><tr><td> 5973E GC / MSD </td><td> Agilent Technologies </td><td> G7021A </td><td> Part # 5975E per GC / MS </td></tr><tr><td> 3-Ethoxymethacrolein </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 232548 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio idrossido </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Diclorometano </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 270997 </td><td></td></tr><tr><td> Benzene </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401765 </td><td></td></tr><tr><td> Etere diisopropile </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 38270 </td><td></td></tr><tr><td> BHT </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1378 </td><td></td></tr><tr><td> Etanolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 459844 </td><td></td></tr><tr><td> Fenilidrazina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P26252 </td><td></td></tr></tbody></table>

misure biochimiche di ipossia neonatale

Biochemical Measurement of Neonatal Hypoxia

Ischemia ipossia neonatale è caratterizzata da inadeguata perfusione sanguigna di un tessuto o una carenza sistemica di ossigeno. Questa condizione è pensato per causare / esacerbare ben documentate patologie neonatali compresi danni neurologici 1-3. Diminuzione della produzione di adenosina trifosfato si verifica a causa della mancanza di fosforilazione ossidativa. Per compensare questo molecole di energia priva di stato contenenti legami fosfato ad alta energia sono 2 degradati. Questo porta ad aumento dei livelli di adenosina, che viene successivamente degradato a inosina, ipoxantina, xantina, e infine ad acido urico. Gli ultimi due passaggi di questo processo di degradazione sono eseguite da xantina ossidoreduttasi. Questo enzima esiste in forma di xantina deidrogenasi in condizioni di normossia ma viene convertito in xantina ossidasi (XO) con ipossia-riperfusione circostanze 4, 5. A differenza di xantina deidrogenasi, XO genera perossido di idrogeno come sottoprodotto della degradazione delle purine 4, 6. Questo perossido di idrogeno in combinazione con altre specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) prodotte durante l&#39;ipossia, ossida l&#39;acido urico ad allantoina forma e reagisce con le membrane lipidiche per generare malondialdeide (MDA) 7-9. Maggior parte dei mammiferi, esseri umani esentati, in possesso dei uricasi enzima, che converte l&#39;acido urico ad allantoina. Negli esseri umani, tuttavia, allantoina può essere formata da ROS-mediate l&#39;ossidazione dell&#39;acido urico. Per questo motivo, allantoina è considerato un marker di stress ossidativo nell&#39;uomo, ma non nei mammiferi che hanno uricasi. Descriviamo impiegando metodi ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia e spettrometria di massa (GCMS) per misurare i marcatori biochimici di ischemia ipossia neonatale. Il sangue umano è utilizzato per maggior parte dei test. Sangue animale può essere utilizzato anche, pur riconoscendo il potenziale di uricasi generati allantoina. Metaboliti purinici sono stati legati all&#39;ipossia già nel 1963 e l&#39;affidabilità di ipoxantina, xantina, acido urico e come indicatori biochimici di ipossia neonatale è stato validato da vari ricercatori 10-13. Il metodo HPLC utilizzato per la quantificazione dei composti purinici è veloce, affidabile e riproducibile. Il GC / MS metodo utilizzato per la quantificazione del allantoina, un marker relativamente nuovo di stress ossidativo, è stato adattato da Gruber et al 7. Questo metodo evita certi artefatti e richiede bassi volumi di campione. I metodi utilizzati per la sintesi di MMDA sono stati descritti in altri 14, 15. GC / MS quantificazione basato su MDA è stato adattato da Paroni et al. e Cighetti et al. 16, 17. Xantina ossidasi è stata misurata mediante HPLC quantificando la conversione di pterina a isoxanthopterin 18. Questo approccio si è rivelato sufficientemente sensibile e riproducibile.

Un metodo è descritto per misurare i marcatori biochimici di ischemia-ipossia neonatale. L&#39;approccio utilizza cromatografia liquida ad alta pressione (HPLC) e gas cromatografia spettrometria di massa (GC / MS).

Misure biochimiche di ipossia neonatale

L'ipossia-ischemia neonatale è caratterizzata da un'insufficiente perfusione ematica di un tessuto o da una carenza sistemica di ossigeno. Si ritiene che questa condizione...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è misurare i marcatori biochimici dell'ischemia ipossica neonatale. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo campioni di sangue da neonati per isolare il plasma. Successivamente, una parte del plasma viene filtrata, combinata con uno standard interno e analizzata per le concentrazioni di ipoxantina, santina e acido urico mediante HPLC due.Successivamente, aliquote di plasma vengono processate e analizzate separatamente in modo differenziale. Per la concentrazione di allantoina e i livelli di MDA mediante GCMS, l'ultimo passaggio della procedura consiste nell'unire una porzione di plasma a un substrato per avviare la reazione enzimatica dopo aver arrestato la reazione. L'attività della xantina ossidasi può essere determinata mediante HPLC dotato di un rivelatore fluorimetrico.In definitiva, si ottengono risultati che mostrano cromatogrammi di aree dei picchi, che possono essere convertiti in concentrazioni molari dei marcatori biochimici desiderati o dell'attività enzimatica mediante curve standard. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia e alla diagnosi dell'ipossia ischemica neonatale poiché questo metodo combina misurazioni di marcatori di deprivazione energetica, stress ossidativo, danno ossidativo e attività enzimatica per generare un quadro biochimico complessivo della presenza e persino del grado di ipossia ischemica. Prima dell'inizio di questa procedura, un campione di sangue umano viene prelevato da un neonato immediatamente dopo la nascita in un tubo da sei millilitri con EDTA entro meno di cinque minuti.Dopo il prelievo, centrifugare il campione a quattro gradi Celsius e 1.500 ×g per 10 minuti. Trasferire il plasma, presente nel sopranatante, in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare per 30 minuti. Rimuovere il sopranatante avendo cura di non contaminare i campioni con globuli rossi.Eluare i campioni in tubi microcentrifuga separati per l'analisi di purine, MDA e xantina ossidasi per ogni misurazione PLC delle purine. Trasferire 200 microlitri del plasma in un dispositivo filtrante centrifugo. Centrifugare il plasma a quattro gradi Celsius e a 14.000 ×g per 1,5 ore.Rimuovere il filtrato e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga contenente due aino purina. Assicurarsi di registrare il volume di filtrato aggiunto alla provetta da microcentrifuga contenente due AP. Per determinare con precisione la concentrazione, vortexare la provetta per 10-20 secondi.Analizzare i campioni mediante HPLC come descritto nel protocollo scritto, utilizzando tre iniezioni da 50 microlitri per ogni campione a partire dai cromatogrammi ottenuti. Determinare la concentrazione di purine nel campione. Quantificare ipoxantina, xantina e acido urico ottenendo le aree dei picchi ai corrispondenti tempi di ritenzione e lunghezze d'onda.Successivamente, quantificare l'area del picco di due AP. A partire da questi dati, è possibile calcolare i rapporti tra le aree di ipoxantina e acido urico rispetto a due AP. Quindi convertire i rapporti in concentrazioni micromolari utilizzando curve standard. Per effettuare la misurazione della lanina, aggiungere 50 microlitri del campione interno e 100 microlitri di acetonitrile a 50 microlitri di plasma.Dopo aver agitato la miscela al vortex per 10-20 secondi, centrifugare per 10 minuti. Rimuovere il sopernatante e trasferirlo in una provetta GCM S.Asciugare il liquido sotto flusso di gas azoto. Una volta che il liquido è asciutto, aggiungere 25 microlitri di agente M-T-B-S-T-F-A e 25 microlitri di piridina. Chiudere la provetta con un tappo e incubare a 50 gradi Celsius per due ore.Trasferire quindi il campione in un altro vial per GCMS con inserto da 300 microlitri. Analizzare i campioni mediante GCMS utilizzando un campionatore automatico. Eseguire la separazione dei composti usando elio come gas trasportatore a una portata di 1,5 millilitri al minuto.Per iniziare l'analisi GCMS, impostare i parametri della corsa. Impostare la temperatura iniziale della colonna a 100 gradi Celsius e mantenere tale temperatura per due minuti prima di aumentarla a 180 gradi Celsius a un ritmo di 10 gradi Celsius al minuto. Mantenere la temperatura per quattro minuti, quindi aumentarla a 260 gradi Celsius a un ritmo di 20 gradi Celsius al minuto.Mantenere questa temperatura fino al termine della corsa. Utilizzare il campionatore automatico per iniettare un microlitro del prodotto DERIVATIZZATO in modalità split ed eseguire la corsa tra ogni analisi campione. Far pulire al campionatore automatico la colonna con due iniezioni di uno a uno di M-T-B-S-T-F-A in piridina.Per quantificare un LAN toin, selezionare la modalità di monitoraggio degli ioni e monitorare l'ione con rapporto massa/carica 398 per l'atlanto in e il rapporto massa/carica 400 per l'atlanto in pesante. Successivamente, convertire i rapporti di abbondanza ionica di atlanto in rispetto all'atlanto in pesante in concentrazioni micromolari di atlanto in, utilizzando una curva standard preparata in precedenza. Prima della misurazione del MDA, preparare le soluzioni di butilato di idrossitoluene e di fenilidrazina 50 millimolari come descritto nel protocollo scritto. Aggiungere M-M-D-A-B-H-T e citrato di sodio al campione di plasma di 100 microlitri.Diluire la miscela finale a 480 microlitri aggiungendo acqua distillata deionizzata. Derivatizzare la soluzione aggiungendo 20 microlitri di idrazina fenilidrazina 50 millimolare. Dopo aver chiuso il vial, incubare la soluzione su uno shaker orbitale.Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di esano, vortexare la miscela per un minuto e centrifugare a 3000 giri al minuto per 10 minuti. Al termine della centrifugazione, trasferire lo strato organico in una provetta da microcentrifuga. Successivamente, concentrare la soluzione fino a 100 µL evaporando sotto un flusso di gas azoto e trasferirla in un file A-G-C-M-S con inserto da 300 µL.Successivamente, analizzare i campioni su A-G-C-M-S utilizzando il campionatore automatico per la separazione dei composti e la quantificazione dell'MDA come descritto nella procedura scritta. Iniziare il rilevamento dell'attività della santhe ossidasi preparando due provette per i campioni di plasma: una da incubare con il substrato per zero minuti come controllo, e una da incubare per quattro ore.Come previsto dall'esperimento, aggiungere tampone e substrato a ogni provetta. Incubare i campioni in preincubazione a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Avviare la reazione enzimatica aggiungendo 60 microlitri di plasma a ogni provetta.Aggiungere immediatamente 300 microlitri di acido perclorico al 4% al tubo di incubazione zero. Al contrario, lasciare incubare l'altra miscela per quattro ore a 37 gradi Celsius prima di arrestare la reazione mediante l'aggiunta di acido perclorico. Vortexare il tubo di controllo a incubazione zero e quindi sottoporlo a centrifugazione.Rimuovere 500 microlitri del soprannatante e aggiungerli a un tubo contenente 20 microlitri di carbonato di potassio 5 M per neutralizzare la reazione; vorticare il campione neutralizzato e centrifugare per la seconda volta. Successivamente, aggiungere 350 microlitri della soluzione neutralizzata in un tubo da microcentrifuga contenente due ap. Dopo un'incubazione di quattro ore, bloccare la reazione aggiungendo 300 microlitri di acido perclorico al 4%.Continuare l'elaborazione del campione come eseguito per il campione di controllo. Analizzare i campioni su un'HPLC dotata di un rivelatore a fluorescenza con scansione. Impostare i parametri utilizzando condizioni socratiche con un flusso di un millilitro al minuto.Per ottenere una separazione e identificazione adeguate dei picchi, impostare la lunghezza d'onda di eccitazione del rivelatore a fluorescenza a 340 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 410 nanometri tre 50. Vengono effettuate iniezioni di microlitro sull'HPLC per ogni campione dopo la corsa HPLC. Determinare il rapporto tra ISO terina e due AP ottenendo le aree dei picchi dallo spettro del rivelatore a fluorescenza.Il primo picco nello spettro a circa cinque minuti corrisponde a due ap. Il secondo e più grande picco sarà terran. Il picco di ISO antho terin eluisce per ultimo; ottenere la differenza tra i rapporti delle aree dei picchi ISO ANTOIN e due AP nei punti temporali di incubazione zero e quattro ore.Utilizzare questo valore per calcolare l'attività della xantina ossidasi a partire dalle curve standard. Un esempio della quantificazione HPLC di composti purinici è mostrato; i tempi specifici di ritenzione e le lunghezze d'onda di emissione di acido urico, ipoxantina e xantina permettono la quantificazione simultanea dei composti purinici. Quando il saggio viene eseguito correttamente, i composti presenteranno una separazione adeguata e la forma dei picchi sarà nitida e unimodale.Se ci sono bolle d'aria nel sistema HPLC, i tempi di ritenzione si sposteranno e la pressione dell'HPLC fluttuerà notevolmente. Se la cartuccia di protezione necessita di essere sostituita, la pressione aumenterà e i picchi si allargheranno, diventando bimodali o trimodali come mostrato in questo esempio qui. Un esempio della quantificazione mediante GCMS della lanina è mostrato poiché la lanina massivamente derivatizzata e la lanina derivatizzata pesante sono note.La modalità di selezione ionica può essere utilizzata per identificare questi composti sullo spettrometro di massa. Se il saggio viene eseguito correttamente, verranno osservati due picchi allo stesso tempo di ritenzione. Un picco corrisponde ad Alan Toin e l'altro a toin pesante.I risultati della quantificazione di MDA sono simili a quelli di Alan Toin, con la differenza che le due picchi sono osservati a tempi di ritenzione diversi. In questo caso, si osserva un picco del rapporto carico/master a 144 per MDA e un picco del rapporto carico/master a 158 per MMDA. Un esempio della quantificazione basata su HPLC della funzione xantina ossidasi è mostrato al tempo di incubazione di zero minuti e al tempo di incubazione di quattro ore.Se il saggio viene eseguito correttamente, dovrebbero essere osservati tre picchi con il rivelatore fluorescente: uno per due ap, uno per Terran e uno per ISO terin. Si noti che il picco di ISO terin è più alto dopo un tempo di incubazione di quattro ore, a causa dell'aumentata attività dell'enzima santhe ossidasi. Poiché questo saggio misura la funzione enzimatica, il congelamento e scongelamento ripetuto del campione potrebbe alterarla.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come misurare con precisione diversi marcatori biochimici dell'ipossia ischemica neonatale.

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Modelli animali di grandi dimensioni hanno buoni valori di traslazione nell'esame della fisiologia e farmacologia di asfissia neonatale. Utilizzando suinetti appena nati, sviluppiamo un protocollo sperimentale per simulare asfissia neonatale che presenta i vantaggi di studiare l'emodinamica sistemica e regionali, trasporti ossigeno con vie biochimiche e patologiche e correlazioni.

Un modello di asfissia neonatale suina

Abbiamo combinato nel dominio della frequenza del vicino infrarosso misure di spettroscopia di ossigenazione dell'emoglobina cerebrale con misure di spettroscopia di correlazione di diffuse indice flusso ematico cerebrale per stimare un indice di metabolismo dell'ossigeno. Abbiamo testato l'utilità di questa misura come strumento di screening letto per valutare la salute e lo sviluppo del cervello neonato.

Non invasiva di misurazione ottica del metabolismo cerebrale ed emodinamica nei neonati

L'encefalopatia ipossico-ischemica a seguito di asfissia perinatale può essere studiata utilizzando modelli animali. Dimostriamo le procedure necessarie per stabilire un modello di suinetto di encefalopatia ipossico-ischemica neonatale.

Un modello di Piglet neonatale Hypoxic-ischemica Encefalopatia

Questo articolo descrive la metodologia per la somministrazione di brevi periodi di ipossia intermittente per postnatali giorno 1-8 di topo o ratto cuccioli. Questo approccio suscita effettivamente un livello del tessuto robusto "effetto priming" su colture di cellule progenitrici neurali che vengono raccolte entro 30 minuti dall'esposizione ipossia.

Consegna di<em&gt; In Vivo</em&gt; Acuta intermittente ipossia in Neonatale Roditore al Primo subventricolare Zone-derivati ​​colture cellulari progenitrici neurali

Il non anestetizzato modello pecore fetale cronicamente strumentato viene utilizzato per studiare lo sviluppo del feto umano in salute e malattia, perché permette l'inserimento chirurgico e manutenzione di cateteri ed elettrodi, ripetitivo prelievi di sangue, iniezione di sostanze, registrazione dell'attività bioelettrica, e imaging in vivo. Si descrivono le procedure necessarie per stabilire questo modello.

Strumentazione di A breve termine pecore fetale per multivariata cronica Recordings non anestetizzati

L'imaging microcircolatorio (MI) viene utilizzato per monitorare la perfusione periferica in neonati gravemente malati o pretermine. Questo manoscritto e video dimostrano l'approccio ottimale per ottenere immagini di alta qualità.

Transcutanea microcircolatoria Imaging in pretermine neonati

Questo protocollo è progettato per aiutare i medici a misurare l'ossigenazione dei tessuti regionali in diversi siti corporei nei neonati e nei bambini. Può essere utilizzato in situazioni in cui l'ossigenazione dei tessuti è potenzialmente compromessa, in particolare durante il bypass cardiopolmonare, quando si utilizzano dispositivi di assistenza cardiaca non pulsatile e in neonati, neonati e bambini gravemente malati.

Come somministrare la spettroscopia del vicino infrarosso in neonati, neonati e bambini gravemente malati

Presentiamo un protocollo per misurare la saturazione regionale di ossigeno (rSO2) nei pazienti in emodialisi (HD) utilizzando un monitor spettroscopico nel vicino infrarosso. Il valore rSO2 è un indice di ossigenazione dei tessuti. Questo monitoraggio non invasivo e in tempo reale potrebbe essere utile per confermare i cambiamenti nell'ossigenazione degli organi durante la MH.

Misura dell'ossigenazione tissutale mediante spettroscopia nel vicino infrarosso in pazienti sottoposti a emodialisi

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipossia nei topi neonatali somministrandoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I modelli murini sottoposti a variazioni di ossigeno alla nascita hanno variato durevolmente l'espressione dei miRNA coinvolti nell'induzione di cambiamenti fenotipici comportamentali come l'autismo.

L'ipossia altera i livelli di miRNA coinvolti nell'ereditarietà non mendeliana del disturbo dello spettro autistico nei topi

Scopri come misurare marcatori biochimici di ipossia neonatale usando HPLC e GC/MS su campioni di plasma. Questo metodo analizza metaboliti come ipoxantina e acido urico per diagnosticare precocemente l'ischemia.

Misure biochimiche di ipossia neonatale

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