Name: Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: Scopri il protocollo di isolamento delle isole di Langerhans da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo metodo consente di ottenere isole umane vitali per studi funzionali sul diabete di tipo 2 e fisiologia pancreatica.

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Vogliamo ringraziare i nostri tanti colleghi che hanno fornito aiuto, pareri e contributi critici nelle varie fasi del progetto. La produzione di questo articolo il video è stato sostenuto con i fondi del ministero tedesco dell&#39;Istruzione e della ricerca (BMBF) al Centro tedesco per Diabetes Research (DZD, <a href="http://www.dzd-ev.de">http://www.dzd-ev.de</a> ), IMIDIA ( <a href="http://www.imidia.org">http://www . imidia.org</a> ) e l&#39;Ospedale Universitario Carl Gustav Carus a Dresda University of Technology. La ricerca ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) per l&#39;iniziativa medicina innovativa nell&#39;ambito della convenzione di sovvenzione n ° 115005.

1. Collezione di tessuti del pancreas in sala operatoria <ol><li> Il chirurgo esegue una resezione parziale del pancreas. </li><li> Dopo aver posizionato il campione del pancreas in una scatola su ghiaccio, lo consegnerà immediatamente al patologo. </li></ol> 2. Selezione dei tessuti per l'isolamento delle isole <ol><li> Il patologo seleziona tessuto che appare morbida e sana, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Campioni di tessuto fibrotico e offrendo meno di 2 g di tessuto utilizzabile sono esclusi dalla isolamento delle isole. </li><li> Immergere il tessuto pancreatico in soluzione di Euro Collins e fornire sul ghiaccio al laboratorio. </li></ol> 3. Isolamento di isole umane <ol><li> Pesare il tessuto pancreatico, poi metterlo in un piatto da 10 cm. </li><li> Mettere 150 ml RPMI dei media in un pallone da 500 ml. </li><li> In un pallone da 250 ml, preparare la soluzione enzima digestivo, combinando 130 ml RPMI media con 100 mg / ml di DNasi e 20 ml di RI Liberase 5mg/ml. Disegna 10 ml di questa soluzione in una siringa per iniettare il tessuto pancreatico. </li><li> Iniettare la soluzione di enzima digestivo nel tessuto pancreatico, al fine di distendere la omogeneo. Se questo è impedito da fibrosi, la digestione probabilmente fallire. Poi, tritare il tessuto in ~ 4 mm 3 pezzi su ghiaccio. </li></ol> 4. Pancreas umano circuito digestione <ol><li> Montare il circuito digestione, come mostrato nella Figura 1. La direzione del flusso nella camera di Ricordi è in basso e fuori nella parte alta della camera. </li><li> Aggiungere la restante soluzione enzima digestivo al pallone da 500 ml fino ad un volume totale di 300 ml e inserire un termometro. </li><li> Trasferire il tessuto pancreatico nella camera, inserire le maglie (pori di diametro: 600 micron) e tre Marmi nitruro di silicio (diametro: 15 mm), chiudere la camera e avviare la pompa con il flusso fissato a 140 ml / min. </li><li> Quando la temperatura del circuito raggiunge i 37 ° C, inizio i tempi e periodicamente prelevare campioni per determinare quando interrompere la digestione. Colorazione con ditizone (2 mg / ml) permette la visualizzazione di isolette microscopiche all'interno del tessuto digerito 4. </li><li> Una volta le isole sono separate dal tessuto acinare circostante, in modo rapido fermare la digestione ponendo la batteria di riscaldamento sul ghiaccio e aggiungendo 200 ml di supporti lavaggio a freddo (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) al circuito. </li><li> Raccogliere la soluzione isolotto in 250 ml provette coniche come si esce dalla provetta. Continuare fino a quando il circuito è vuoto. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2962/2962fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. L'uomo circuito digestione pancreas Il pancreas umano circuito digestione comprende una camera di Ricordi che contiene mesh (pori di diametro: 600 micron) e tre palline di nitruro di silicio (diametro: 15 mm). Uscita dalla camera è spinto al pallone raccolta tessuto dalla pompa peristaltica (140 ml / min). Le frecce indicano la direzione del flusso. Una temperatura ottimale per la digestione enzimatica viene mantenuta immergendo la bobina di riscaldamento in un bagno d'acqua a 37 ° C. 5. Lavaggio post-digestione <ol><li> Centrifuga da 250 ml provette coniche contenente la soluzione isolotto a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante, risospendere il pellet isolotto a lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e distribuirlo in frazioni pari a 50 ml provette coniche. (Opzionale:. Distribuire in tubi conici aggiuntive per migliorare il lavaggio) Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Gettare il surnatante e delicatamente allentare pellet agitando manuale. </li></ol> 6. Purificazione su un gradiente di Ficoll <ol><li> Risospendere il pellet con Ficoll i media ad una densità di 1,125 g / ml, pH 7.4 e lentamente sovrapposizione di 10 ml di Ficoll mezzi con densità di 1,080, 1,060 e 1,037 g / ml. </li><li> Centrifugare i gradienti di Ficoll a 2400 rpm, 4 ° C per 20 min. </li></ol> 7. Isolotto Raccolta e Cultura <ol><li> Dopo la centrifugazione, componenti del tessuto differenti si distinguono per la loro scomposizione del gradiente. </li><li> Eliminare lo strato superiore costituito da grassi e tessuto connettivo. </li><li> Accuratamente raccolto il primo strato di inerti isolotto alla g / ml 1,037-1,060 interfase. Questo strato contiene le isole più puro isolato. Raccogliere separatamente le frazioni per l'isolamento efficiente. </li><li> Raccogliere la seconda frazione meno puro di aggregati isolotto alla g / ml 1,060-1,080 interfase. </li><li> Diluire il gradiente di Ficoll con l'aggiunta di lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) a ciascuna provetta conica fino ad un volume totale di 50 ml. Centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. </li><li> Eliminare il surnatante tramite aspirazione. Usare la stessa attenzione il pellet potrebbe essere sciolto a causa del gradiente di Ficoll. </li><li> Lavare il wi pellet° lavare i media (900 ml RPMI 1640 con 5,5 mM di glucosio e il 10% FBS) e centrifugare a 1000 rpm, 4 ° C per 5 min. Ripetere utilizzando terreni di coltura isolotto </li><li> Risospendere le isolette in terreni di coltura e metterli in incubatore al 5% di CO 2 a 37 ° C per 24-48 ore prima di ulteriori elaborazioni. </li></ol>

<ol><li>Kahn, S. E., Zraika, S., Utzschneider, K. M., Hull, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beta+cell+lesion+in+type+2+diabetes%3A+there+has+to+be+a+primary+functional+abnormality%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The beta cell lesion in type 2 diabetes: there has to be a primary functional abnormality.</a> Diabetologia. 52, 1003-1012 (2009).</li>
<li>Deng, S., Vatamaniuk, M., Huang, X., Doliba, N., Lian, M. M., Frank, A., Velidedeoglu, E., Desai, N. M., Koeberlein, B., Wolf, B., Barker, C. F., Naji, A., Matschinsky, F. M., Markmann, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+abnormalities+in+the+islets+isolated+from+type+2+diabetic+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Structural and functional abnormalities in the islets isolated from type 2 diabetic subjects.</a> Diabetes. 53, 624-632 (2004).</li>
<li>Ricordi, C., Lacy, P. E., Finke, E. H., Olack, B. J., Scharp, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+method+for+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Automated method for isolation of human pancreatic islets.</a> Diabetes. 37, 413-420 (1988).</li>
<li>Latif, Z. A., Noel, J., Alejandro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+staining+fresh+and+cultured+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">A simple method of staining fresh and cultured islets.</a> Transplantation. 45, 827-830 (1988).</li>
<li>Ehehalt, F., Knoch, K., Erdmann, K., Krautz, C., Jäger, M., Steffen, A., Wegbrod, C., Meisterfeld, R., Kersting, S., Bergert, H., Kuhlisch, E., Bornstein, S., Bonifacio, E., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+insulin+turnover+in+islets+from+type+2+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Impaired insulin turnover in islets from type 2 diabetic patients.</a> Islets. 2, 30-36 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed?</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2. S165-S169 (2008).</li>
<li>Meisterfeld, R., Ehehalt, F., Saeger, H. D., Solimena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders+and+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Endocrinol+Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders and diabetes mellitus.</a> Exp Clin Endocrinol Diabetes. 116, Suppl 1. S7-S12 (2008).</li>
<li>Verge, C. F., Gianani, R., Kawasaki, E., Yu, L., Pietropaolo, M., Jackson, R. A., Chase, H. P., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+type+I+diabetes+in+first-degree+relatives+using+a+combination+of+insulin%2C+GAD%2C+and+ICA512bdc%2FIA-2+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prediction of type I diabetes in first-degree relatives using a combination of insulin, GAD, and ICA512bdc/IA-2 autoantibodies.</a> Diabetes. 45, 926-933 (1996).</li>
<li>Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition%2C+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+and+its+complications.+Part+1%3A+diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus+provisional+report+of+a+WHO+consultation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabet+Med%22%5BJournal%5D)">Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation.</a> Diabet Med. 15, 539-553 (1998).</li>
<li>Marselli, L., Thorne, J., Ahn, Y. B., Omer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+of+Purified+%7Bbeta%7D-Cell+Tissue+Obtained+from+Human+Pancreas+with+Laser+Capture+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene Expression of Purified {beta}-Cell Tissue Obtained from Human Pancreas with Laser Capture Microdissection.</a> Journal of Clin. Endocrinol. Metab. 93, 1046-1053 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Utilizzando il nostro protocollo, isole umane può essere isolato dal tessuto pancreatico prelevato da un pancreatectomia parziale. Il successo di questo protocollo si basa sulla cura posta nella alcuni punti critici. Per preservare la vitalità delle cellule beta, è essenziale che il campione da trasportare rapidamente sul ghiaccio al laboratorio. Inoltre, la durata della digestione dei tessuti deve essere ottimizzata empiricamente a seconda del grado di fibrosi dei tessuti e l&#39;attività enzimatica dei media. Questo vale anche per il grado di forza meccanica applicata manualmente alla camera di Ricordi. In tal modo di ottenere un buon rendimento isolotto, il protocollo è meglio eseguita da uno scienziato dedicato o assistente tecnico. Errore iniziale è la norma a meno che la squadra è già sperimentato in isolamento isole. Ci sono differenze fondamentali tra il nostro protocollo isolotto isolamento e lo standard umano metodo di isolamento delle isole: 1) Anche se usiamo tessuto pancreatico sottoposto a diverse ore di ischemia durante la procedura chirurgica, viene immediatamente trasformato in loco. Questo è in contrasto con pancreas espiantati da donatori in morte cerebrale per il pancreas / trapianto di isole, che rimangono ischemico per diverse ore durante l&#39;assegnazione e la consegna alla struttura isolamento delle isole. 2) Noi collagenasi iniettare direttamente nel tessuto pancreatico, mentre il protocollo standard è quello di infondere in dotto pancreatico. 3) Abbiamo separato le isole con un gradiente discontinuo Ficoll invece di raccogliere le isolette da un gradiente Ficoll continuo utilizzando un processore COBE cellula. Nei casi in cui il campione chirurgico è troppo fibrotica o scarsa per isolare un numero adeguato di isolotti, il tessuto può essere ancora recuperato la cattura microdissezione laser (LCM) 10. Questo permette ai dati di espressione genica da recuperare praticamente ogni esemplare, anche se l&#39;isolamento delle isole non riesce o la resa è molto bassa. Purtroppo, LCM non produce le cellule viventi per gli studi funzionali e il loro ammontare è di solito insufficiente per l&#39;analisi proteomica. Così, con LCM in parallelo con il nostro protocollo collagenasi digestione per recuperare le isole possono essere il modo più efficace al processo di campioni chirurgici. Quando si raccolgono i tessuti per l&#39;isolamento delle isole da pancreatectomies parziale, è importante esaminare attentamente la storia clinica del paziente e stato metabolico. Un paziente parzialmente pancreatectomized potrebbero essere interessati dal tipo 3c diabete, il diabete secondario cioè al disordine del pancreas porta alla chirurgia 6. Tra i 43 pazienti partecipanti che hanno subito questo intervento nel nostro reparto nel 2010, 32 erano non-diabetici, 5 erano affetti da diabete di tipo 2 e 6 avevano il diabete di tipo 3c. Questi dati concordano con gli studi precedenti che punta al metabolismo del glucosio e diabete in una frazione considerevole di pazienti affetti da cancro al pancreas o pancreatite cronica 6. Abbiamo considerato il diabete sia di origine primaria, se è stato diagnosticato da almeno un anno prima della comparsa dei sintomi principali della chirurgia pancreatica 7. I livelli di anticorpi contro l&#39;isolotto autoantigeni deve essere misurato per valutare un potenziale origine autoimmune del diabete 8. Perché un paziente sottoposto ad pancreatectomia potrebbe soffrire di diabete non diagnosticato o essere intolleranti al glucosio, tutti i pazienti non diabetici devono assumere un test orale di tolleranza al glucosio prima della pancreatectomia 9.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><th> Attrezzatura </th><th></th><th></th></tr><tr><td> 1 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 604181 </td></tr><tr><td> 10 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 607180 </td></tr><tr><td> 25 ml pipetta sierologica (Cellstar) </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 760180 </td></tr><tr><td> Siringa da 10 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300912 </td></tr><tr><td> Siringa da 50 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Siringa da 5 ml </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 309050 </td></tr><tr><td> 18 G 1,1 / 2 Ago Microlance 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 304622 </td></tr><tr><td> 27 GX1 / 2 aghi </td><td> Braun </td><td> 4658300 </td></tr><tr><td> 27 GX3 / 4 Microlance dell&#39;ago 3 </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 302200 </td></tr><tr><td> 3 centimetri coltura cellulare piatto 2x2 mm griglia </td><td> Nunc </td><td> 174926 </td></tr><tr><td> 20 centimetri tessuto piatto cultura </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> 6 centimetri piatto facile presa petri </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 351016 </td></tr><tr><td> 150 ml di stoccaggio bottiglia </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431175 </td></tr><tr><td> 250 ml beute </td><td> Schott Duran </td><td> 217 21 36 </td></tr><tr><td> 500 ml beute </td><td> Schott Duran </td><td> 217 21 44 </td></tr><tr><td> 250 ml Tappo a vite conica inferiore provetta </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430776 </td></tr><tr><td> 50 ml Falcon conica del tubo </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 352070 </td></tr><tr><td> 260 ml Easyflask non trattati </td><td> Nunc </td><td> 156800 </td></tr><tr><td> Millex GV Filtro Unità Duropore (0,22 micron) </td><td> Millipore </td><td> SLGV033RB </td></tr><tr><td> Bottiglia vuoto Top filtro (PES 70 millimetri Diametro Membran, 0,22 micron dimensione dei pori, 45 collo di dimensione mm, 500 ml) </td><td> Corning Incorporated </td><td> 431118 </td></tr><tr><td> Densitometro (Densito 30PX) LWE37463 </td><td> Mettler Toledo </td><td> 51324450 </td></tr><tr><td> Veloce Unità PES filtro 0,2 micron </td><td> Nalgene </td><td> 569-0020 </td></tr><tr><td> Riscaldamento Coil </td><td> BioRep Technologies Inc </td><td> HC-02 </td></tr><tr><td> Multifuge 4 KS-R </td><td> Heraeus </td><td> 75015680 </td></tr><tr><td> Pompa Tipo PD5206 </td><td> Heidolph </td><td> 523-52060-00-2 </td></tr><tr><td> Ricordi camera (rete metallica con 600 micron di diametro dei pori) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> Modello 50-U-01, Serial 0503-001 </td></tr><tr><td> Preparazione stand </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> 50-PS-01 </td></tr><tr><td> O-Ring </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> O-50-U-01 </td></tr><tr><td> Marmi nitruro di silicio (15 mm di serie 9) </td><td> BioRep Technologies Inc. </td><td> SN-01 </td></tr><tr><td> Tubi in silicone </td><td> Tygon </td><td> R 3603 8,0 X4, 0 mm </td></tr><tr><td> Pinze chirurgiche </td><td> Braun </td><td> BD168R </td></tr><tr><td> Forbici chirurgiche (Aesculap) </td><td> Braun </td><td> BC273R </td></tr><tr><td> Bagnomaria OLS 200 </td><td> Concedere </td><td> OLS 200 </td></tr><tr><th> Reagenti </th><th></th><th></th></tr><tr><td> Collagenasi -&gt; RI Liberase (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 11815032001 </td></tr><tr><td> D (+)-glucosio </td><td> Merck </td><td> 1.08337.1000 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Merck </td><td> 1.16743.1000 </td></tr><tr><td> Diphenylthiocarbazone (DTZ) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> D5130 </td></tr><tr><td> DNasi I (100 mg) </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> Dulbeccos 1xPBS </td><td> PAA Laboratori </td><td> H15-002 </td></tr><tr><td> Electrolytsolution E154 </td><td> Serumwerk </td><td> 00509 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> PAA Laboratori </td><td> A15-101 </td></tr><tr><td> Ficoll 400 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> F9378 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino (FBS) </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td></tr><tr><td> 2 - (4 - (2-idrossietil) - 1-piperazinyl)-ethansulfons ‰ URE (HEPES) </td><td> Roth </td><td> 9105,3 </td></tr><tr><td> NaOH, 5 M </td><td> farmacia clinica, ospedale </td><td> - </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina (100x) </td><td> PAA Laboratori </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> Pipettaid (EXPRESS) </td><td> BD (Becton, Dickinson and Company) </td><td> 357591 </td></tr><tr><td> Potassiumchlorid </td><td> Fluka </td><td> 60132 </td></tr><tr><td> Potassiumdihydrogenphospate anidro </td><td> JT Baker </td><td> 0241 </td></tr><tr><td> Potassiummonohydrogenphosphate </td><td> JT Baker </td><td> 3246-01 </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 [-] D-glucosio [+] L-Glutammina </td><td> Gibco </td><td> 11879-020 </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 [+] L-Glutammina </td><td> PAA Laboratori </td><td> E15-840 </td></tr><tr><td> Sodiumhydrogencarbonat </td><td> Merck </td><td> 1.06329.0500 </td></tr></tbody></table> Mezzi di comunicazione e soluzioni Ditizone Soluzione <ul><li> DTZ Sciogliere 100 mg in 10 ml di DMSO e diluire in 40 ml di PBS </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Soluzione enzima <ul><li> Sciogliere 100 RI Liberase mg in 20 ml di RPMI mezzi di comunicazione 1640 (senza supplementi) </li><li> Sciogliere 100 mg in 1 ml DNasi RPMI 1640 i media (senza supplementi) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) e mantenere l&#39;enzima su ghiaccio </li></ul> Lavare i media (1000ml/5.5mM glucosio) <ul><li> Sciogliere 100 ml di FBS (inattivato con il calore) </li><li> Aggiungere 450 ml di RPMI 1640 (senza glucosio) </li><li> Aggiungere 450 ml di RPMI 1640 (11 mM glucosio) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Isolotto cultura dei media (500ml / 5,5 mM glucosio) <ul><li> Si sciolgono 10 HEPES ml 1M (pH 7,4) </li><li> Aggiungere 50 ml di FBS </li><li> Aggiungere 5 ml di penicillina / streptomicina (100x) </li><li> Aggiungere 2,75 ml 1 di soluzione glucosata al M </li><li> Aggiungi 432,25 ml RPMI 1640 (senza glucosio) </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Euro Collins Soluzione <ul><li> 4.083 g di potassio hydrogenphosphate </li><li> 70,0 g di glucosio </li><li> 2.237 g di cloruro di potassio </li><li> 14,80 g di potassio monohydrogenphosphate </li><li> 1.680 g di sodio bicarbonato </li><li> 40 ml di soluzione elettrolitica (E 154) </li><li> pH 7,4 </li><li> Aggiungere acqua distillata fino a 2000 ml </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) </li></ul> Ficoll Soluzione <ul><li> Aggiungere 1000 ml di soluzione di Euro Collins a 500 g Ficoll </li><li> Aggiungere 8,94 g HEPES </li><li> Mescolare fino a quando una notte Ficoll è risolto </li><li> pH 7,4 </li><li> Misurare la densità </li></ul> Ficoll gradienti <ul><li> Calcolare la quantità di FBS, Euro Solution Collins e soluzione stock Ficoll in base alla densità </li><li> Combina le 3 soluzioni e misurare la densità con un densitometro </li><li> Aggiungi Euro Collins soluzione o soluzione stock Ficoll prima che la densità viene regolata </li><li> Filtro sterile la soluzione (0,22 micron) e conservare a 4 ° C </li></ul>

isolamento di isole umane da pazienti parzialmente pancreatectomized

Isolation of Human Islets from Partially Pancreatectomized Patients

Indagini sulla patogenesi del diabete di tipo 2 e le isole di Langerhans malfunzionamento 1 sono stati ostacolati dalla limitata disponibilità di isolette con diabete di tipo 2 da donatori di organi 2. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare dal tessuto isole pancreatiche umane ottenute da diabete di tipo 2 e pazienti non diabetici che hanno subito pancreatectomia parziale a causa di diverse malattie del pancreas (tumori benigni o maligni del pancreas, pancreatite cronica, e del dotto biliare comune o tumori duodenali) . Tutti i pazienti coinvolti hanno dato il loro consenso a questo studio, che era stato approvato dal comitato etico locale. I campioni chirurgici sono stati immediatamente consegnati al patologo che hanno selezionato morbido e sano tessuto pancreatico che appaiono per l&#39;isolamento delle isole, mantenendo il tessuto danneggiato per scopi diagnostici. Abbiamo scoperto che per isolare più di 1.000 isole, abbiamo dovuto iniziare con almeno 2 g di tessuto pancreatico. Anche essenziale per il nostro protocollo è stato quello di distendere visibilmente il tessuto quando si somministra l&#39;enzima contenente i media e successivamente macinata per aiutare la digestione, aumentando la superficie. Per estendere l&#39;applicabilità del nostro protocollo di includere il caso in cui occasionalmente una quantità di grandi dimensioni (&gt; 15 g) di tessuto pancreatico umano è disponibile, abbiamo usato una camera di Ricordi (50 ml) per digerire il tessuto. Durante la digestione, si scosse manualmente la camera di Ricordi 3 a un&#39;intensità che varia da campione in base al suo livello di fibrosi tissutale. Un gradiente discontinuo Ficoll è stato poi utilizzato per separare le isolette dal tessuto acinare. Abbiamo notato che il precipitato di tessuto dovrebbe essere abbastanza piccolo da essere omogeneamente risospeso in medium Ficoll con una densità di 1,125 g / ml. Dopo l&#39;isolamento, abbiamo colto gli isolotti in condizioni di stress (senza agitazione o rotazione) con il 5% CO 2 a 37 ° C per almeno 48 ore al fine di facilitare il loro recupero funzionale. Applicazione diffusa del nostro protocollo e il suo miglioramento futuro potrebbe consentire la raccolta puntuale di grandi quantità di isole umane da diabetici e clinicamente abbinati soggetti non diabetici, notevolmente avanzando la ricerca sul diabete di tipo 2.

Il nostro protocollo ha dato una media di circa 500 isolotti per grammo di tessuto pancreatico, anche se questo varia notevolmente tra i preparati in gran parte dovuta a differenze di fibrosi e di attività collagenasi. Abbiamo raggiunto la purezza isolotto&gt; 90% dalla colorazione prima con ditizone durante la lavorazione dei tessuti, poi 24 ore dopo la raccolta manuale isolamento. Per determinare la qualità delle isole purificate, abbiamo testato per 25 mM glucosio-stimolata la secrezione di insulina in condizioni statiche per 2 ore. Abbiamo trovato la secrezione di insulina paragonabile a quella di isolotti ottenuto dall&#39;isolamento ECIT isole e centri di trapianto. Come isolette isolate dal pancreas parzialmente pancreatectomized non sono stati pensati per il trapianto di isole, la valutazione della IEQ totale non è stato considerato un fattore critico. È importante sottolineare che il nostro metodo ci ha permesso di isolare isolotti per gli studi funzionali da 25 pazienti parziale pancreatectomized tra il 2005 e 2008 5. Queste isole sono stati analizzati per il glucosio-stimolata la secrezione di insulina e di espressione delle proteine ​​specifiche da western blotting ed immunoistochimica. Isolette isolate da parte pancreatecomized pancreas potrebbe anche essere utilizzato per confrontare profili di espressione genica e proteica, l&#39;aspetto ultrastrutturale e le risposte funzionali di isole non-diabetici e diabetici. Perché ci sono più pazienti sottoposti a pancreatectomia parziali che ci sono donatori di organi, il nostro protocollo potrebbe consentire abbastanza campioni e dati da raccogliere per una ben fondata analisi statistica.

La fornitura di diabete di tipo 2 isolotti per la ricerca è insufficiente. Qui condividiamo il nostro protocollo per isolare isolotti da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo approccio rappresenta un luogo unico per l&#39;ottenimento di isolotti da diabete di tipo 2 e clinicamente abbinati soggetti non diabetici ed in numero sufficiente per gli studi di base e clinica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

Le indagini sulla patogenesi del diabete di tipo 2 e sul malfunzionamento delle isole di Langerhans 1 sono state ostacolate dalla limitata disponibilità di tipo 2...

Ciao, sono Florian Al del Dipartimento di Chirurgia della Università Tecnica di Triton. Ciao, sono Gregor Cher, anch'io del Dipartimento di Chirurgia dell'Ospedale Universitario di Grayston.È urgentemente necessaria la ricerca sulla biologia e sulla funzione delle palpebre per approfondire la nostra comprensione della fisiologia palpebrale e della patogenesi del diabete. Sfortunatamente, è molto difficile ottenere palpebre umane da pazienti non diabetici e da pazienti con diabete di tipo due. La seguente sequenza video illustrerà un protocollo per isolare palpebre umane da pazienti con ottimizzazione pancreatica parziale.Gli isolotti così ottenuti possono funzionare come un sistema in vitro per l'analisi funzionale. La resezione chirurgica del tessuto pancreatico umano è la condizione preliminare per l'isolamento degli isolotti umani. Ci affidiamo su pazienti sottoposti a resezione parziale del pancreas per specifiche patologie pancreatiche.Come fonte di tessuto pancreatico umano, il chirurgo effettua un'incisione nel pancreas e pratica una resezione parziale. Successivamente, il campione pancreatico viene posto su ghiaccio e trasportato al Dipartimento di Anatomia Patologica. Il patologo determina la quantità di tessuto pancreatico sano e di consistenza morbida da prelevare.Per l'isolamento delle isole, sono necessari almeno due grammi di tessuto pancreatico. Il tessuto viene posto in soluzione Ucon e trasportato su ghiaccio al laboratorio. Il primo passaggio nella procedura di isolamento delle isole consiste nel misurare il peso del tessuto pancreatico.Il campione viene quindi posizionato in una piastra da 10 centimetri. Abbiamo già preparato un matraccio da 500 millilitri con 150 millilitri di terreno RPMI e un matraccio da 250 millilitri con 130 millilitri di terreno RPMI. Successivamente, aggiungiamo la soluzione enzimatica di digestione contenente un millilitro di DNAsi e 20 millilitri di collaghenasi al matraccio da 250 millilitri e la aspiriamo in una siringa da 10 millilitri.Il tessuto pancreatico pulito viene quindi disteso mediante l'iniezione di un mezzo contenente enzimi e ridotto in piccoli pezzi per aumentare la superficie disponibile e facilitare il processo di digestione. Questo passaggio di trinciatura è cruciale perché la distensione ottenuta soltanto tramite iniezione non consente una distribuzione adeguata dell'enzima all'interno del tessuto. Parallelamente, abbiamo assemblato il circuito di digestione.Come mostrato in questa figura, la direzione del flusso nella camera registrata è in ingresso nella parte inferiore e in uscita nella parte superiore della camera. Successivamente, aggiungiamo il mezzo contenente l'enzima rimanente al matraccio da 500 millilitri fino a un volume di 300 millilitri, quindi inseriamo il termometro. La camera registrata contiene una rete metallica con un diametro dei pori di 600 micrometri e sfere di nitruro di silicio libere con un diametro di 15 millimetri ciascuna.Trasferiamo il tessuto pancreatico nella camera, inseriamo la maglia, chiudiamo la camera e avviamo la pompa con una velocità di 140 millilitri al minuto. Una volta che la temperatura del circuito raggiunge 37 gradi Celsius, iniziamo a misurare il tempo di digestione. La camera registrata viene agitata a mano in base alla composizione del tessuto.Per determinare il punto temporale ottimale per interrompere la digestione, preleviamo periodicamente dei campioni, li coloriamo con tisone e osserviamo al microscopio gli anellini separati, che appaiono rossi. Una volta che gli anellini sembrano essere separati dal tessuto aino, interrompiamo rapidamente la digestione ponendo la bobina riscaldante sul ghiaccio e aggiungendo 200 millilitri di mezzo di lavaggio freddo al circuito. Successivamente, raccogliamo la soluzione delle palpebre inserendo il tubo del campione in provette falcon da 250 millilitri fino a quando il circuito non è vuoto.La seguente procedura di lavaggio inizia con il passaggio di centrifugazione a 1000 giri al minuto a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Nel passaggio successivo, si elimina il surnatante, si risospende la soluzione della palpebra nel mezzo di lavaggio e si distribuisce in frazioni uguali nei tubi falcon da 50 millilitri. Il lavaggio prosegue con un ulteriore passaggio di centrifugazione a 1000 giri al minuto a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Come passaggio facoltativo, distribuiamo la paletta in ulteriori provette oltre alle quattro originali, a seconda delle dimensioni della paletta. Per migliorare il lavaggio, scartiamo nuovamente il sopranatante e allentiamo delicatamente la paletta per separare la palpebra dal tessuto aine. Le diverse densità dei due tessuti consentono l'applicazione di un gradiente fecale.Prima di tutto, risospendiamo il pellet nel mezzo fecale di densità 1,125 grammi per millilitro. Il pellet deve essere abbastanza piccolo da permettere una risospensione omogenea. Successivamente, sovrapponiamo lentamente questo con i mezzi fecali di densità 1,08, 1,060 e 1,037, con un volume di 10 millilitri ciascuno.Successivamente, centrifughiamo i gradienti a 2.400 giri/min per 20 minuti a quattro gradi Celsius. A questo punto è possibile distinguere i diversi componenti separati in base alle loro densità nelle frazioni. Per prima cosa, eliminiamo lo strato superiore costituito da grasso e tessuto connettivo.La frazione che raccogliamo ora è il primo strato dell'aggregato della palpebra a 1.037 e 1.06, che contiene principalmente gli occhietti isolati. Per un'isolamento efficiente, è importante raccogliere le frazioni separatamente. Successivamente, raccogliamo la frazione del secondo aggregato della palpebra all'interfaccia tra 1.060 e 1.080, che contiene occhietti meno puri rispetto al primo strato.Successivamente, aggiungiamo il mezzo di lavaggio fino a un volume totale di 50 millilitri per diluire il gradiente fecale e inviamo in FUT a 1000 giri al minuto per cinque minuti. A quattro gradi Celsius, eliminiamo l'agente SUP per aspirazione poiché il pellet potrebbe essere molto fragile a causa del freddo. Pertanto, dobbiamo ripetere il passaggio di lavaggio con mezzo di coltura per cellule della palpebra a 1000 giri al minuto per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Nell'ultimo passaggio, risospendiamo gli anellini oculari umani e la coltura, insieme al mezzo di coltura. Gli anellini raccolti vengono posti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 24-48 ore. Al termine di questo passaggio di coltura, le palpebre sono pronte per ulteriori elaborazioni.Questo protocollo dovrebbe consentirvi di isolare le palpebre umane dal tessuto pancreatico dopo una pancreatectomia parziale. Il trasporto rapido e fresco del tessuto pancreatico al centro di isolamento delle palpebre è fondamentale per preservare la migliore vitalità cellulare. Il team di isolamento deve tenere presente che il processo di digestione è una procedura altamente dinamica.La durata del processo di digestione dipende fortemente dalla composizione del tessuto. Ad esempio, dal grado di fibrosi e dalla capacità di iniettare in modo adeguato l'enzima nel tessuto pancreatico. L'adeguamento individuale della forza meccanica all'interno della camera registrata e la durata del processo di digestione sono fondamentali per ottenere un'elevata resa di isole pancreatiche.

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Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento delle isole pancreatiche umane: Parte I: Digestione e Collezione di tessuto pancreatico

Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (parte II: la purificazione e la cultura di isole umane) utilizzando un metodo modificato automatizzato.

Isolamento del pancreas umano Islet: Parte II: La purificazione e la cultura di isole umane

Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che producono ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Questo protocollo spiega un metodo per isolare le isole pancreatiche mediante prima perfusione di collagenasi tramite l'ampolla di Vater per digerire il tessuto pancreatico esocrino e una centrifugazione semplificata in gradiente di densità per purificare le isole dai topi.

Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Descriviamo qui un protocollo per isolare isolotti intatti da topi neonati. Pancreas sono stati parzialmente digerito con collagenasi, seguita da lavaggio e raccolta manuale. 20 - 80 clusters insule possono essere ottenuti per pancreas da topi appena nati, che sono adatti per diversi studi insulari.

Efficace isolamento di isole funzionali da neonatali mouse Pancreas

Questo protocollo di isolamento dell'isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell'isolotto. Il successo dell'isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.

Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Qui, forniamo dettagli sull'esecuzione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare del topo con un pancreas intatto come tecnica aggiuntiva per valutare la funzione endocrina del pancreas con riduzione di possibili fattori confondenti.

Secrezione di insulina stimolata dal glucosio attraverso la perfusione attraverso il sistema vascolare dei topi con un pancreas intatto

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre in modo efficiente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intercellulare nella patogenesi del diabete indotto da pancreatite acuta.

Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo protocollo descrive un metodo standardizzato per il prelievo chirurgico, la digestione enzimatica e la purificazione con gradiente di densità degli isolotti pancreatici del ratto Lewis, consentendo preparazioni ad alta resa e alta purezza per l'uso diretto in studi di trapianto o in vitro .

Isolamento e purificazione degli isoli pancreatici da ratti Lewis tramite digestione enzimatica e separazione tra densità e gradiente

Scopri il protocollo di isolamento delle isole di Langerhans da pazienti sottoposti a pancreatectomia parziale. Questo metodo consente di ottenere isole umane vitali per studi funzionali sul diabete di tipo 2 e fisiologia pancreatica.

Isolamento di isole umane da pazienti parzialmente Pancreatectomized

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