Introduzione alla tecnica di distruzione mirata ad ultrasuoni microbolle

UTMD è l'acronimo di distruzione mirata di microbolle mediante ultrasuoni. L'UTMD può essere utilizzato per indirizzare la somministrazione specifica di molecole bioattive, inclusi geni terapeutici, a organi bersaglio accessibili agli ultrasuoni, come il cuore e il fegato. Nell'UTMD, molecole bioattive come plasmidi carichi negativamente o vettori di DNA che codificano un gene di interesse vengono aggiunti agli involucri catonici di agenti di contrasto a base di microbolle lipidiche; le microbolle legate ai vettori possono quindi essere somministrate per via endovenosa o direttamente nel ventricolo sinistro del cuore.

In animali più grandi, possono essere somministrati anche mediante un catetere coronarico con o senza periodo di permanenza. Il rilascio successivo dalla circolazione verso un organo bersaglio avviene in modo ottimale attraverso la cavitazione acustica a una frequenza risonante delle microbolle. È probabile che l'energia meccanica generata dalla distruzione delle microbolle determini la formazione transitoria di pori nelle cellule endoteliali o tra queste, nel microcircolo della regione bersaglio.

Di conseguenza di questo effetto sauna parion, l'efficienza di trasfezione nelle cellule endoteliali e attraverso di esse aumenta, consentendo il deposito di vettori codificanti transgeni nel tessuto circostante di interesse. Il DNA plasmidico rimasto in circolo viene rapidamente degradato dalle nucleasi presenti nel sangue durante la preparazione dei microbolle. Un'aliquote di una soluzione madre di microbolle preparata contenente glucosio, soluzione salina tamponata al fosfato, fosfatidilcolina diolo glicerolo tre e diolo glicerolo tre.

Il fosfatidil etanolammina viene prima incubato a 40 gradi Celsius per 15 minuti. La soluzione riscaldata di microbolle viene quindi trasferita in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente glicerolo e da uno a due milligrammi di DNA plasmidico purificato che codifica per un costrutto di espressione del gene di interesse. Viene aggiunto del soluzione salina tamponata al fosfato fino a un volume finale di 500 microlitri.

L'aria nel microtubo viene quindi sostituita con gas ottatetrafluoropropano. Il microtubo viene quindi agitato vigorosamente in un amalgamatore dentale per 20 secondi. La calibrazione dell'apparecchiatura prima del primo utilizzo richiede che il trasduttore di cavitazione UTMD da un megahertz venga calibrato per garantire un corretto indice meccanico e ripetizione dell'impulso.

Un trasduttore subacqueo da un megahertz è collegato a un generatore di forme d'onda tramite un amplificatore di potenza. Il trasduttore viene posizionato in un contenitore di plastica pieno d'acqua, puntato direttamente verso un idrofono, che è stato collegato a un oscilloscopio mediante un amplificatore di carica. Frequenza, ampiezza, numero di cicli del burst e amplificazione della potenza del segnale possono essere modificati per ottenere il duty cycle e l'indice meccanico ottimali per cavitare i microbolle. In questa configurazione, abbiamo calibrato il sistema su un indice meccanico pari a circa 1,3 a un megahertz per la somministrazione di microbolle e UTMD prima della somministrazione delle microbolle e U-T-M-D-C 57 BL sei topi vengono anestetizzati con 100 milligrammi per chilogrammo di chetamina e cinque milligrammi per chilogrammo di xilazina mediante iniezione intraperitoneale.

L'amministrazione dei microbolle avviene per via endovenosa mediante iniezione diretta nel ventricolo sinistro del cuore o attraverso la cateterizzazione della vena della coda, come verrà mostrato successivamente per l'iniezione cardiaca diretta. Un volume fino a 100 microlitri di soluzione di microbolle cariche di DNA plasmidico viene iniettato attraverso un ago da 30 gauge inserito nello spazio intercostale anteriore del quarto spazio intercostale sotto visualizzazione ecografica nel ventricolo sinistro del cuore. Il bolo di soluzione di microbolle risultante dall'iniezione intraventricolare sinistra viene visualizzato utilizzando un trasduttore ad ultrasuoni ad alta frequenza di VisualSonics posizionato in modo fisso sul torace del topo in una vista sull'asse lungo.

Immediatamente dopo l'iniezione, viene effettuata la distruzione dei microbolle per circa cinque minuti, utilizzando un secondo trasduttore di dimensioni più piccole e a bassa frequenza, da 1,0 megahertz, posizionato direttamente sull'organo desiderato per indirizzare la distruzione a questa regione. L'ultrasuono viene somministrato al fegato con una frequenza di ripetizione degli impulsi di 1,0 megahertz, un indice meccanico pari a circa 1,3-1,5 e un periodo di ripetizione dell'impulso di 100 millisecondi ogni 20 cicli; oppure l'impulso può essere sincronizzato all'ECG del topo per emettere un burst di tre frame di ultrasuono ogni quattro-sei cicli cardiaci. Per la somministrazione dei microbolle tramite la vena della coda, il topo viene anestetizzato nello stesso modo di un topo a cui viene somministrata una siringa contenente il plasmide.

I microbolle legati al DNA sono collegati a un catetere per via venosa caudale con ago da 27 gauge. Il catetere viene inserito nel terzo distale di una delle due vene laterali che decorrono lungo la coda del topo. La siringa contenente i microbolle è posizionata in una pompa per infusione che erogherà automaticamente un volume preimpostato uniforme di soluzione in un periodo di tempo prestabilito.

Analisi della bioluminescenza di UTMD, l'efficacia del trasferimento plasmidico di DNA mediato da UTMD può essere valutata attraverso diversi metodi, a seconda dei geni presenti nel costrutto. In particolare, l'imaging della bioluminescenza in vivo rappresenta un metodo che consente di monitorare la presenza e la durata dell'espressione genica. In topi transfettati con il plasmide che codifica per un gene reporter di bioluminescenza, come la luciferasi.

Il sistema di imaging in vivo Enogen viene utilizzato per la bioluminescenza. Le immagini sono generalmente acquisite per tutti i topi il primo giorno successivo alla trasfezione mediata da UTMD e vengono ripetute ogni tre o quattro giorni fino a quando l'espressione genica della bioluminescenza non è più visivamente rilevabile attraverso il sistema. Per preparare i topi all'imaging bioluminescente, questi ricevono innanzitutto un'iniezione intraperitoneale (IP) della sonda reporter luciferasi Lucifer.

I topi vengono quindi anestetizzati. Circa tre minuti dopo, si permette alla distribuzione biologica del substrato Lucifer di procedere per circa 10 minuti prima di posizionare l'animale o gli animali nella camera di imaging Xeno Gen ed eseguire una scansione dell'immagine corporea completa durante l'acquisizione, rilevando i fotoni emessi dalla reazione fotochimica della luciferasi di Lucifer. Il sistema determina tali fotoni dopo l'acquisizione di ciascuna immagine.

Utilizzando il sistema di imaging in vivo Xeno, il software del sistema viene impiegato per misurare e quantificare la regione visibile di interesse luminescente.