Targeting neuroni bulbo olfattivo utilizzo combinato In Vivo Elettroporazione e GAL4-Based Enhancer Trappola Linee Zebrafish
15 agosto 2011
La risoluzione temporale e spaziale di manipolazioni genetiche determina lo spettro di fenomeni biologici che possono turbare. Qui usiamo temporalmente e spazialmente discreto In vivo Elettroporazione, combinate con linee transgeniche di zebrafish, per indurre l'espressione di un transgene GFP specificatamente nei neuroni del bulbo olfattivo sviluppo.
Questo metodo illustra come la combinazione di elettroporazione in vivo temporale e spazialmente selettiva con linee transgeniche di pesce zebra possa indirizzare in modo specifico le regioni dell'embrione in via di sviluppo per l'espressione del transgene. Si inizia con pesci transgenici cal TA4 ottenuti mediante il metodo del trappolamento dell'enhancer, al fine di limitare l'espressione genica e i tipi cellulari di interesse. In questo caso, durante lo sviluppo del bulbo olfattivo in un momento specifico, si inietta il plasmide reporter GFP nell'estremità anteriore del proencefalo in vivo ed esegue l'elettroporazione per facilitare il trasferimento del DNA. I risultati ottenuti mediante imaging della fluorescenza in vivo indicano una localizzazione precisa del transgene in un momento e in un processo specifico dello sviluppo.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'iniezione del plasmide allo stadio di una singola cellula, è che l'espressione è mirata a specifici tipi cellulari all'interno di una regione specifica del cervello in via di sviluppo. Utilizzare la linea transgenica di pesce zebra creata mediante un metodo di trappola dell'enhancer mediato per indurre l'espressione sia del fattore di trascrizione calt A four sia della proteina reporter M cherry in specifiche regioni del cervello in via di sviluppo. Incrociare pesci adulti eterozigoti per l'inserzione transgenica con pesci di tipo selvatico per ottenere circa il 50% di prole transgenica.
Ora trattare gli embrioni transgenici con 100 micromolar e fenil trea, a partire da sei a otto ore. Dopo la fecondazione, per bloccare la formazione del pigmento e facilitare l'analisi fluorescente a 24-28 ore dalla fecondazione, trasferire gli embrioni in acqua per uova senza PTU e, sotto un microscopio a fluorescenza, identificare gli embrioni transgenici mediante l'espressione di M cherry nel microonde. Preparare una soluzione allo 0,5% di aros a basso punto di fusione nel buffer per elettroporazione più trica, quindi equilibrare la soluzione.
In un incubatore a 34-37 gradi Celsius, posizionare una goccia grande, di circa 500 microlitri della soluzione agro, al centro di una piastra di Petri da 60 millimetri. Utilizzando pinzette fini, rimuovere la membrana corionica dagli embrioni transgenici. Trasferire gli embrioni liberati in una piastra di Petri contenente buffer per elettroporazione più anestetico trica allo 0,02% per due minuti.
Ora trasferire sei-otto embrioni anestetizzati nella goccia preparata di aros utilizzando punte di pipetta Michael tagliate. Posizionare gli embrioni in modo che siano tutti rivolti nella stessa direzione e allineati in una fila verticale. Intrappolare gli embrioni in posizione solidificando l'aros mediante una grande piastra di Petri contenente due-tre millimetri di ghiaccio.
Inondare la piastra con tampone di elettroporazione più trica, assicurandosi che la soluzione ricopra completamente la goccia di aros solidificata. Preparare il plasmide purificato per l'espressione di GFP con colorante rosso fenolo per l'iniezione. Preparare ora le micropipette per microiniezione utilizzando una punta di pipetta micro loader.
Aggiungere uno o due microlitri di soluzione plasmidica di DNA alla pipetta di iniezione, quindi montare e fissare la pipetta caricata nel portapipetta del sistema di iniezione a pressione. Arretrare la punta della pipetta caricata inserendola energicamente attraverso un dischetto di cotone imbevuto fino a quando impulsi di pressione producano il rilascio POF della soluzione rossa di DNA, con la pipetta orientata verso l'estremità anteriore del cervello in via di sviluppo. Iniettare la soluzione di DNA plasmidico nei ventricoli del cervello in via di sviluppo mediante iniezione a pressione.
Forza il DNA in prossimità del bulbo olfattivo in via di sviluppo. Iniettare il DNA fino a quando il colorante rosso risulti chiaramente visibile all'estremità anteriore del ventricolo telencefalico. Procedere immediatamente al passaggio di elettroporazione per evitare la diffusione e la diluizione del DNA.
Impostare lo stimolatore SD nine per produrre singoli impulsi di elettroporazione della durata di cinque millisecondi, a 70 volt. Posizionare gli elettrodi in modo che l'elettrodo positivo sia adiacente all'estremità interna dell'embrione, mentre l'elettrodo negativo si trovi posteriormente rispetto alla testa dell'embrione.
Avviare manualmente otto impulsi di elettroporazione utilizzando un singolo interruttore della stimolatrice SD nine. Separare ogni impulso di un secondo. Lasciare riposare gli embrioni per almeno 10 minuti.
Ora, utilizzando pinzette fini, delineare delicatamente il contorno degli embrioni evitando il contatto diretto con gli embrioni stessi. Successivamente, liberare gli embrioni dall'agarosio. Restituire gli embrioni nell'acqua delle uova e conservarli a 28 gradi Celsius fino all'analisi dell'espressione di GFP.
Trasferire gli embrioni in acqua per uova più anestetico trica allo 0,02% per alcuni minuti come in precedenza, ma al centro di una piccola piastra di Petri da 35 millimetri. Aggiungere una grossa goccia di soluzione allo 0,5% di agarosio a basso punto di fusione in acqua per uova più trica. Aggiungere ora un embrione anestetizzato a questa goccia di agarosio utilizzando punte di pipetta microloader tagliate.
Posizionare l'embrione in posizione eretta per facilitare una vista dorsale del cervello in via di sviluppo sotto un microscopio verticale. Solidificare gli aros sul ghiaccio e utilizzare punte di microloader tagliate per mantenere l'orientamento dell'embrione. Infine, inondare la piastra con acqua di uovo più trica, assicurandosi che la soluzione ricopra completamente la goccia di aro solidificata.
Questo esempio combina la risoluzione temporale dell'elettroporazione in vivo con un'espressione specifica per tipo cellulare mediata da linee transgeniche con trappola di enhancer, al fine di indirizzare il bulbo olfattivo in via di sviluppo. La linea transgenica con trappola di enhancer mostra un'espressione costitutiva di mCherry e caltA4 nel cervelletto del romboencefalo, nel telencefalo e nel bulbo olfattivo negli embrioni a cinque giorni post-fecondazione. In modo importante, quattro giorni dopo l'elettroporazione, le cellule che esprimono GFP mostrano proiezioni assonali tipiche delle cellule mitrali del bulbo olfattivo.
Questo confronto tra i segnali di M Cherry e l'esposizione ridotta di GFP dimostra che i corpi cellulari che esprimono GFP sono effettivamente localizzati nel bulbo olfattivo utilizzando costrutti di RNA a forcina corta. Questa procedura può anche essere utilizzata per indurre la perdita di funzione in tipi cellulari specifici del cervello in via di sviluppo.
Panoramica
Questo studio illustra un metodo per l'espressione genica mirata nel bulbo olfattivo in via di sviluppo del pesce zebra mediante elettroporazione in vivo. Combinando questa tecnica con linee transgeniche, i ricercatori possono ottenere un controllo preciso della localizzazione spaziale e temporale dell'espressione genica.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Manipolazione genetica
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- L'elettroporazione in vivo permette il rilascio mirato di DNA in regioni specifiche di embrioni in via di sviluppo.
- Le linee di pesce zebra transgeniche possono limitare l'espressione genica a tipi cellulari specifici.
- Il bulbo olfattivo è un'area fondamentale per lo studio dello sviluppo neuronale.
- La risoluzione temporale e spaziale nelle manipolazioni genetiche è essenziale per comprendere i processi di sviluppo.
Scopo dello studio
- Illustrare un metodo per indurre l'espressione genica in specifici neuroni del bulbo olfattivo del pesce zebra.
- Confrontare l'efficacia di questo metodo con le tecniche tradizionali di iniezione di plasmidi.
- Esplorare la possibilità di condurre studi sulla perdita di funzione mediante l'uso di costrutti a RNA a forcina corta (shRNA).
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di linee di pesce zebra transgenico derivate da metodi di trappolamento dell'enhancer.
- Iniezione del plasmide reporter GFP nel proencefalo seguita da elettroporazione.
- Immagini di fluorescenza per confermare la localizzazione dell'espressione del transgene.
- Parametri di elettroporazione impostati per ottenere una consegna ottimale del DNA.
Risultati principali
- Indirizzamento riuscito dell'espressione di GFP al bulbo olfattivo in specifici stadi di sviluppo.
- Proiezioni assonali dimostrate di cellule mitrali del bulbo olfattivo che esprimono GFP.
- Il confronto tra i segnali di M Cherry e GFP ha confermato la localizzazione dell'espressione del transgene.
- È stata stabilita la possibilità di indurre una perdita di funzione in tipi cellulari specifici.
Conclusioni
- Il metodo fornisce uno strumento potente per lo studio della funzione genica in popolazioni neuronali specifiche.
- Offre vantaggi rispetto ai metodi tradizionali consentendo un'espressione mirata in regioni definite.
- Questo approccio può migliorare la nostra comprensione dei processi dello sviluppo cerebrale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un controllo preciso della espressione del transgene nello spazio e nel tempo in popolazioni neuronali definite, supportando la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale della scoperta in neuroscienze. Combinando l'elettroporazione in vivo con linee di tipo enhancer trap, fornisce un sistema riproducibile per analizzare la funzione genica in circuiti rilevanti per la malattia. L'approccio aumenta l'affidabilità predittiva nella selezione degli obiettivi riducendo gli effetti fuori bersaglio e permettendo studi di perdita di funzione in specifici tipi cellulari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in popolazioni neuronali definite del bulbo olfattivo.
- Valore operativo: Fornisce un'espressione transgenica spazialmente limitata per chiarire la funzione genica in specifici tipi cellulari.
- Valore predittivo: Supporta la riduzione del rischio biologico collegando la modulazione del bersaglio a fenotipi assonali nelle cellule mitrali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative di fluorescenza per valutare l'induzione di transgeni e i modelli di proiezione assonale.
- Valore operativo: Permette la preparazione standardizzata di embrioni elettroporati per imaging e analisi riproducibili.
- Scalabilità: Consente test multiplex di reagenti mediante elettroporazione simultanea di RNAi o costrutti CRISPR in linee transgeniche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Colpisce i neuroni del bulbo olfattivo, un sistema rilevante per i modelli di disturbi neurosviluppativi e neurodegenerativi.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del target nella fase di scoperta allo screening fenotipico in modelli preclinici di zebrafish.
- De-risking meccanicistico: Permette l'analisi della perdita di funzione mediante shRNA per valutare la necessità del target nella formazione dei circuiti neuronali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro della fase iniziale della scoperta, consentendo la verifica di ipotesi sui bersagli prima dell'identificazione del capostazione e supportando la preparazione dei saggi per lo screening fenotipico in modelli vertebrati.
- Biologia della scoperta: Permette test basati su ipotesi della funzione genica in specifiche popolazioni neuronali mediante espressione transgenica controllata spazialmente e temporalmente.
- Screening: Produce output standardizzati e quantificabili di fluorescenza che supportano la valutazione riproducibile di composti o perturbazioni genetiche.
- Analisi: Consente il confronto tra pattern di proiezione assonale e localizzazione cellulare come letture quantitative per la modulazione del bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Collega la validazione precoce del bersaglio a saggi fenotipici in modelli di zebrafish di malattie neurologiche.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per indirizzare diverse regioni cerebrali utilizzando diverse linee di enhancer trap e coordinate di elettroporazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie all'espressione transgenica specifica per tipo cellulare e a letture fenotipiche.
- Valore operativo: Standardizzazione della preparazione degli embrioni, dei parametri di elettroporazione e dei protocolli di imaging tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione progettuale riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi neuronali degli obiettivi.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio degli obiettivi basata sulla validazione funzionale in circuiti neurali rilevanti per la malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze nell'embriologia del pesce zebra, nelle tecniche di microiniezione e di elettroporazione.
- Accesso alla microscopia fluorescente e a linee transgeniche con trappole di enhancer aventi pattern di espressione definiti.
- Standardizzazione della progettazione dei costrutti di DNA e delle condizioni del buffer per l'elettroporazione, al fine di garantire riproducibilità.
- Considerazioni adattative per il targeting di altre regioni cerebrali mediante l'uso di linee con trappole di enhancer alternative.
- Le limitazioni includono una variabile efficienza di elettroporazione e la necessità di ottimizzare la concentrazione del DNA e i parametri dell'impulso.
