Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre un metodo affidabile per studiare le risposte motorie delle cellule ciliate esterne o OHC, inclusa l'elettromotilità, la motilità lenta e la flessione alle frequenze acustiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando le ossa temporali da criceti, topi o altri animali mammiferi, e aprendo la bolla per esporre la coclea. Il secondo passaggio consiste nell'immergere la coclea in Lebovits L 15, rimuovendo la regione apicale della capsula ossea, il legamento spirale e la pagliuzza di vais, ed eliminando l'organo del Corti.

Dopo un'incubazione di cinque minuti dell'organo del Corti in collagenasi ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro, questo viene trasferito nella camera di registrazione mediante una siringa Hamilton da 50 microlitri, e le cellule vengono dissociate passandole avanti e indietro attraverso l'ago. La camera di registrazione viene quindi posizionata sul microscopio per stimolare le cellule con un campo elettrico alternato esterno e registrare mediante videocamera ad alta velocità le risposte motili delle cellule ciliate esterne isolate. Infine, la elettromotilità, la motilità lenta e la flessione delle cellule ciliate esterne a frequenze acustiche possono essere valutate mediante analisi d'immagine assistita da computer.

Iniziare questa procedura prelevando le ossa temporali da criceti, topi o altri modelli animali mammiferi. Quindi aprire le ossa temporali utilizzando pinzette adatte. Per esporre il coclea, rimuovere con attenzione l'osso in eccesso mantenendo intatto il rivestimento osseo del coclea e immergerlo in L-15 livi.

Al microscopio, aprire la regione apicale della coclea. Rimuovere il dryer, i VASIs e il legamento spirale con la punta di una lama di bisturi, un ago microchirurgico o una pinzetta fine. Rimuovere l'organo del Corti dalla modiolo cocleare usando la pinzetta.

Successivamente, posizionare il coclea in collaghenasi ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro, a temperatura ambiente per cinque minuti. Se sono necessarie cellule ciliate dall'estremità basale del coclea, rimuovere il rivestimento osseo che copre la base del coclea con il puntale e separare la spirale dall'osso temporale utilizzando la lama del bisturi. Prima di rimuovere l'organo del Corti, trasferire l'organo del Corti nella camera di registrazione utilizzando una siringa Hamilton da 50 microlitri. Quindi dissociare le cellule facendole passare ripetutamente attraverso l'ago.

Di seguito è riportato lo schema del generatore di campo elettrico alternato esterno e dei collegamenti con il sistema di acquisizione delle immagini, i circuiti di controllo e il software appositamente implementato presso il nucleo ingegneristico dell'House Ear Institute. L'allestimento sperimentale utilizzato in questo esperimento comprende un microscopio invertito Axia vert 1 3 5 TV dotato di un sistema di illuminazione alternativo basato su LED e due micromanipolatori elettronici. Sono presenti tre report video sul microscopio: una fotocamera ultra veloce PhotoTron FastCam PCI X 10 24 controllata da PC nel teletrasporto, che offre un'elevata risoluzione e acquisisce immagini ad alte frequenze fino a 100.000 FPS.

Le immagini fornite dalla telecamera ad alta velocità vengono osservate direttamente sul monitor del PC. Una telecamera CCD standard aggiuntiva, collegata al portello oculare, è connessa a un monitor ad alta risoluzione. Una fotocamera digitale convenzionale montata sul portello frontale permette l'acquisizione di singoli fotogrammi. Un software sviluppato in laboratorio, in esecuzione sullo stesso PC, controlla l'azionamento della telecamera ad alta velocità, il sistema di illuminazione e il campo elettrico alternato esterno.

I due elettrodi, costituiti da due fili di argento del diametro di 0,25 millimetri con una distanza tra le punte di 0,8 millimetri montati su un micromanipolatore elettrico. Successivamente, calibrare il campo elettrico utilizzando un elettrodo esterno. Questo elettrodo misura il potenziale elettrico in diversi punti, generando una mappa del campo elettrico.

Se una singola cellula ciliata esterna isolata viene posizionata tra le punte degli elettrodi con il suo asse longitudinale parallelo al campo elettrico alternato applicato, essa si muove allungandosi e accorciandosi alla stessa frequenza del campo elettrico. Ad esempio, qui viene mostrata una cellula stimolata a 50 hertz e registrata a 1000 fotogrammi al secondo. Questa immagine successiva mostra una cellula stimolata a quattro kilohertz e registrata a 18.000 fotogrammi al secondo.

Se la cellula viene posizionata perpendicolarmente al campo, può essere osservato e analizzato un diverso tipo di flessione della cellula ciliata esterna. Questa cellula, ad esempio, si piega quando viene stimolata a 50 hertz con un campo elettrico perpendicolare al suo asse maggiore. Le cellule ciliate esterne possono mostrare variazioni di forma in risposta a stimolazioni non elettriche.

Questa risposta è chiamata motilità lenta e può essere studiata anche con questa tecnica. Selezionare diverse stimolazioni tra i quattro protocolli differenti. Il primo è la frequenza singola continua.

Si noti che è possibile selezionare la modalità di stimolo, la frequenza, l'ampiezza e il tipo di onda, che vengono indicati con cerchi rossi mediante il software di controllo fatto in casa. Il secondo protocollo di stimolazione è a frequenza singola a raffiche, in cui la durata delle raffiche e gli intervalli tra le raffiche sono regolabili. Il terzo è a scansione lineare, in cui le frequenze iniziale e finale sono regolabili.

Il quarto protocollo di stimolazione è la stimolazione multipla, che permette la combinazione di diverse modalità di stimolo. Dopo aver selezionato i parametri corrispondenti, il software di controllo configura il sistema e consente all'operatore di avviare la registrazione video sincronizzata con la luce e la stimolazione cellulare cliccando un singolo pulsante sullo schermo del computer. In questo filmato, le cellule ciliate esterne isolate mostrano variazioni nella lunghezza o nella curvatura quando vengono stimolate con un campo elettrico alternato esterno parallelo o trasversale, rispettivamente, al loro asse longitudinale.

Le risposte delle cellule ciliate esterne vengono analizzate in post-elaborazione utilizzando la funzione di tracciamento delle caratteristiche del software Pro Analysts. Qui è mostrata una cellula ciliata esterna stimolata a una frequenza di 50 hertz e registrata a 1000 fotogrammi al secondo. Il software fornisce la distanza tra due punti fotogramma per fotogramma, come mostrato qui durante l'accorciamento cellulare. La distanza tra i punti selezionati all'apice, indicato in rosso come piastra cuticolare, e alla base della cellula, indicata in verde come polo basale, è minore e aumenta con l'allungamento della cellula; il software esegue un'analisi fotogramma per fotogramma delle variazioni della lunghezza della cellula ciliata esterna.

Il pannello nella parte inferiore dell'immagine mostra la traccia del movimento. In questo esempio, la lunghezza totale variabile è di circa 6,5 pixel. Di seguito è riportato un esempio che dimostra come il bordo della cellula possa essere rilevato e come l'area della sezione ottica possa essere misurata automaticamente mediante la funzione di tracciamento del contorno con il software pro analys.

In questo esperimento, microsfere di polistirene vengono aggiunte in modo casuale e fissate saldamente alla membrana plasmatica nella soluzione di bagnatura. Diverse microsfere possono essere selezionate contemporaneamente e il software può seguirle automaticamente quadro per quadro. In questo modo, le cellule possono essere suddivise in sezioni e la motilità di ciascuna sezione può essere valutata in modo indipendente.

Selezionando le microsfere localizzate ai margini laterali della cellula, è possibile valutare in modo indipendente le variazioni della lunghezza di ciascun segmento e le variazioni dell'angolo di un segmento rispetto all'altro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se realizzata correttamente.

Ovviamente, è necessario del tempo aggiuntivo per l'analisi off-line dei filmati registrati. Tuttavia, con un software adeguato, questa analisi può essere completata in circa altre tre ore per ogni filmato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare le risposte motili delle cellule ciliate esterne, inclusa l'elettromotilità, la motilità lenta e la flessione alle frequenze acustiche.