Name: Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri un metodo affidabile per studiare la motilità delle cellule ciliate esterne utilizzando stimolazione elettrica alternata e analisi d'immagine ad alta velocità. Questa tecnica permette di valutare l'elettromotilità e la funzione cocleare.

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Lavoro supportato da National Institutes of Health sovvenzioni R01DC10146/R01DC010397, dell&#39;NIDCD P30 DC006276 Core Research, e istituti di istruzione superiore. Il suo contenuto è esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del NIH o istituti di istruzione superiore. Gli autori dichiarano assenza di conflitto attuale o potenziale di interesse.

1. Isolamento di OHC <ol><li> Iniziare questa procedura per la raccolta delle ossa temporali da cavie, topi o il vostro modello animale dei mammiferi. </li><li> Quindi, aprire le ossa temporali utilizzando una pinza martello al fine di esporre la coclea, e immergile nella Leibovitz L-15. Togliere l'eccesso di osso con attenzione, mantenendo intatto il guscio osseo. Considerando che questa è una procedura generale applicabile alle ossa temporale di qualsiasi specie di mammiferi, piccole modifiche alla tecnica può essere necessaria quando si tratta di ossa temporali da animali molto piccoli. Negli animali vecchi della bolla di solito è calcificato, introducendo un'ulteriore complicazione alla procedura. </li><li> Sotto osservazione microscopica, aprire la regione apicale della coclea e rimuovere vascularis stria e del legamento spirale usando la punta della lama di un bisturi # 11, un punto di micro e scegliere una pinzetta sottile. </li><li> Prendete l'Organo di Corti fuori dal modiolus cocleare con la pinzetta, e lo mise in collagenasi 1mg/ml in L-15 a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Se OHC da trasforma basale della coclea sono necessari, rimuovere il guscio osseo che copre la base della coclea con il piccone, e separare la spirale dal dell'osso temporale con il bisturi prima di rimuovere l'organo di Corti. </li><li> Trasferimento dell'organo del Corti alla camera di registrazione con una siringa da 50 microlitri Hamilton. In seguito, le cellule si dissociano da reflusso attraverso l'ago. </li></ol> 2. Setup sperimentale <ol><li> Schema del campo elettrico alternato Esterne (EAEF) generatore e il loro collegamento con il sistema di acquisizione delle immagini (fig. 1). La circuiteria di controllo è stato appositamente implementato presso il Nucleo di Ingegneria dell'Università degli Ear House Institute. </li><li> Il setup sperimentale utilizzato nei nostri esperimenti è costituito da un microscopio Axiovert 135TV invertito (Zeiss, Thornwood, NY) con un'alternativa basata su LED sistema di illuminazione (LED ad alta potenza del sistema-36AD3500, tecnologie Lightspeed, Campbell, CA), due micromanipolatori elettronica (Eppendorf "PatchMan", Germania), un PC controllato ad altissima velocità Photron Fastcam X 1024 PCI fotocamera (Photron USA Inc.) nel porto Keller e una telecamera aggiuntiva CCD regolari nel porto trinoculare. La fotocamera Fastcam è in grado di catturare immagini ad alta frequenza (fino a 100.000 fps) e ad alta risoluzione (ad esempio, 1024 x 1024 pixel a 1000 fps, 512 x 128 a 10.000 fps, 384 x 96 a 18.000 fps, e così via). Le immagini fornite dalla telecamera ad alta velocità sono osservati direttamente nel monitor del PC, mentre la telecamera CCD è collegata a un altro monitor. Il LED basati su sistema di illuminazione funziona in due modalità differenti: a bassa potenza analogico e digitale ad alta potenza. Tutte le procedure preliminari (posizionamento elettrodi, posizionamento delle cellule, fuoco, ecc) sono eseguite utilizzando le modalità di risparmio energetico analogica. L'elevata potenza di illuminazione si accende l'apertura l'otturatore della fotocamera e poi spenta con la chiusura dell'otturatore, facilitando la dissipazione del calore. Software fatto in casa, anche sviluppato presso il Nucleo Ear Casa Engineering Institute, in esecuzione sullo stesso PC controlla il grilletto della telecamera ad alta velocità, il LED basato su sistema di illuminazione, e la EAEF. Una macchina fotografica digitale convenzionale in porto frontale permette di fotogrammi, se necessario. (Fig. 2 A). </li><li> Elettrodi (due 0,25 millimetri di diametro fili di Ag con la distanza punta di 0,8 mm) sono spinti a posizione utilizzando uno dei micromanipolatori elettronico. Posizione elettrodi 'è monitorato visivamente e attraverso l'immagine microscopica, un cambiamento nel piano focale dell'immagine indica che gli elettrodi toccato il fondo della camera sperimentale. Inizialmente, il campo elettrico viene calibrato utilizzando un elettrodo esterno. Questo elettrodo misura il potenziale elettrico in punti differenti, generando una "mappa" del campo elettrico. Se una singola cellula isolata ciliate esterne è posto tra le punte degli elettrodi con il suo asse longitudinale parallelo alla EAEF applicata, si muoverà allungamento e accorciamento alla stessa frequenza del campo elettrico. Se la cella è posizionato perpendicolarmente al campo un diverso tipo di risposta OHC (flessione) possono essere osservati e studiati. (Fig. 2 B) </li></ol> 3. EAEF stimolazione e l'acquisizione delle immagini <ol><li> Quattro diversi protocolli di stimolazione sono selezionabili (Fig. 3): <ol><li> continuo singola frequenza (Fig. 3 A). Si noti che tipo di modalità di stimolo, frequenza, ampiezza e onda può essere selezionata usando il fatto in casa software di controllo (cerchi rossi). </li><li> scoppiata singola frequenza (Fig. 3 B). La lunghezza delle esplosioni e le lacune tra scoppio sono selezionabili. </li><li> lineare sweep (fig. 3 C). Le frequenze iniziale e finale sono selezionabili. </li><li> multi-stimolazione (Fig. 3 D). Singola frequenza e spazza lineari possono essere combinati in un singolo esperimento. Dopo aver selezionato i parametri corrispondenti, il software di controllo configura il sistema e consente all'operatore di avviare luce sincronizzato registrazione video e la stimolazione delle cellule facendo clic su un solo pulsante insullo schermo del computer. </li></ol></li><li> Le immagini sono catturati in formato AVI per ulteriori analisi ad alte frequenze. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <ol><li> In questo film, due cellule ciliate esterne isolate mostrano cambiamenti nella lunghezza e curvatura, quando sono stimolati da un campo elettrico alternato esterna che è parallela o trasversale, rispettivamente, al loro asse longitudinale. (Movie # 2). </li><li> Risposte OHC mobili vengono analizzati off-line utilizzando il software ProAnalyst (Xcitex Inc., Cambridge, MA). "Tracking Feature" funzione di questo software fornisce la distanza tra due punti di frame-by-frame (Fig. 4). Nel corso delle cellule accorciare la distanza tra i punti selezionati al vertice (cuticolare piatto, di colore rosso) e la base della cellula (polo basale, di colore verde) è più piccolo, e aumenta con l'allungamento delle cellule. Il filmato mostra il software di analisi fotogramma per fotogramma le variazioni di lunghezza. Il pannello in basso l'immagine mostra la traccia del movimento. In questo esempio, la variazione totale in lunghezza è di circa 6,5 ​​pixel. </li><li> "Contour Tracking" funzione nel software ProAnalyst in grado di rilevare automaticamente i bordi delle cellule e misurare l'area della sezione ottica (Fig. 5). </li><li> Microsfere di polistirolo aggiunto alla soluzione del bagno in modo casuale e fermamente allegare alla membrana plasmatica (Fig. 6 A). Diverse microsfere possono essere selezionati contemporaneamente, e il software può automaticamente traccia di tutti i loro fotogramma per fotogramma. In questo modo, le cellule possono essere divise in sezioni e la motilità di ogni sezione valutato in maniera indipendente. (Fig. 6 A) </li><li> Selezionando microsfere trova al margine laterale dell'immagine cellula, variazioni di lunghezza di ciascun segmento e cambiamenti di angolo di un segmento rispetto ad altri (flessione) può anche essere valutato in maniera indipendente. (Fig. 6B) </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schema del generatore EAEF e sui loro collegamenti con il sistema di acquisizione dell'immagine. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un'immagine) del setup sperimentale. B) Particolare del palco microscopio, con vignette raffiguranti il ​​elettrodi e una singola OHC posto tra loro con il suo parallelo all'asse longitudinale del campo elettrico. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. A) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per singola frequenza di stimolazione. I parametri selezionati sono cerchiati in rosso. B) l'interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per scoppiare a frequenza singola stimolazione. C) l'interfaccia utente del fatto in casa software di controllo configurato per la stimolazione scansione lineare. D) Interfaccia utente del software di controllo fatto in casa configurato per il multi-stimolazione. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Singolo fotogramma di uno OHC con due punti selezionati alla base (verde) e l'apice (rosso) della cellula, rispettivamente, con il "tracking Feature" funzione del software ProAnalyst. La curva sotto la cella mostra le variazioni periodiche della distanza tra i punti selezionati associati con la stimolazione elettrica. Spostando la barra verticale telai differenti possono essere selezionati per l'analisi individuale. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Il "Monitoraggio Contour" funzione ProAnalyst rileva il bordo delle cellule e automaticamente misurare l'area della sezione ottica. <img src="/files/ftp_upload/2965/2965fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Un'immagine) Catturato un OHC isolato decorato con microsfere di polistirolo (in alto), e la stessa immagine con cinque microsfere selezionati singolarmente (in basso). Un colore diverso è stato assegnato a ogni microsfera, ed i loro spostamenti possono essere individualmente e automaticamente fotogramma per fotogramma monitorati, analizzati e confrontati. B) segmenti di lunghezza arbitraria può essere definito selezionando polistirolo microsfere trova al margine della cellula, e variazioni di lunghezza di questi segmenti così come i cambiamenti di orientamento di un segmento rispetto ad altri (cella di piegatura) possono essere valutate automaticamente fotogramma per telaio con il software di analisi delle immagini. Movie 1. Isolamento di Guinea OHC maiale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie1_web.mov">Clicca qui per guardare il video</a> Movie 2. OHC parallela e perpendicolare al EAEF mostrando electromotility tipici e le risposte di curvatura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2965/2965_Movie2_web.mov">Clicca qui per guardare il video</a>

<ol><li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+insights+into+the+morphogenesis+of+inner+ear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic insights into the morphogenesis of inner ear hair cells.</a> Nat Rev Genet. 5, 489-498 (2004).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell motility.</a> Physiol Rev. 88, 173-210 (2008).</li>
<li>Dallos, P., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin%2C+a+new+type+of+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Prestin, a new type of motor protein.</a> Nature Rev. Mol. Cell Biol. 3, 104-111 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+outer+hair+cell+bending+in+an+external+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Cochlear outer hair cell bending in an external electrical field.</a> Biophys. J. 73, 1665-1672 (1997).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+Prestin-Dependent+and+Prestin-Independent+Components+from+Complex+Motile+Responses+in+Guinea+Pig+Outer+Hair+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Extraction of Prestin-Dependent and Prestin-Independent Components from Complex Motile Responses in Guinea Pig Outer Hair Cells.</a> Biophys J. 89, 4343-4351 (2005).</li>
<li>Matsumoto, N., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prestin-dependent+and+prestin-independent+motility+of+guinea+pig+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prestin-dependent and prestin-independent motility of guinea pig outer hair cells.</a> Hear Res. 208, 1-12 (2005).</li>
<li>Ashmore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+remarkable+cochlear+amplifier%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">The remarkable cochlear amplifier.</a> Hear Res. 266, 1-17 (2010).</li>
<li>Kitani, R., Kakehata, S., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+responses+of+cochlear+outer+hair+cells+stimulated+with+an+alternating+electrical+field%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Motile responses of cochlear outer hair cells stimulated with an alternating electrical field.</a> Hearing Research. , (2011).</li>
<li>Dallos, P., Evans, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+outer+hair+cell+motility%3A+corrections+and+addendum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-frequency outer hair cell motility: corrections and addendum.</a> Science. 268, 1420-1421 (1995).</li>
<li>Frank, G., Hemmert, W., Gummer, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limiting+dynamics+of+high-frequency+electromechanical+transduction+in+outer+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Limiting dynamics of high-frequency electromechanical transduction in outer hair cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 4420-4425 (1999).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+frequency+limit+and+phase+of+outer+hair+cell+motility%3A+effects+of+the+membrane+filter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">On the frequency limit and phase of outer hair cell motility: effects of the membrane filter.</a> J. Neurosci. 12, 1906-1916 (1992).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%22">Video Microscopy</a>. , Plenum Press. New York. (1986).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo sperimentale presentato qui permette di valutare le risposte OHC mobili della gamma kHz senza alcuna restrizione al movimento della cellula. Protocolli di stimolazione differenti, altri marker (microsfere), come pure i cambiamenti nell&#39;orientamento della cella con riguardo al campo elettrico, permettono di indagare nuovi aspetti della motilità OHC con un livello di dettaglio precedentemente inaccessibili. Altri metodi, ad esempio quelli che utilizzano fotodiodi 9 o laser Doppler vibrometria <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco </td><td> 21083 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi (Tipo 4) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C5138 </td><td> 1mg/mL in L-15 </td></tr></tbody></table>

indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità image analysis

Investigating Outer Hair Cell Motility with a Combination of External Alternating Electrical Field Stimulation and High-speed Image Analysis

OHC sono cilindriche cellule sensomotorio trova l&#39;organo del Corti, l&#39;organo uditivo all&#39;interno dell&#39;orecchio interno dei mammiferi. Il nome &quot;cellule ciliate&quot; deriva dal loro caratteristico fascio apicale di stereociglia, un elemento critico per la rilevazione e trasduzione di energia sonora 1. OHC sono in grado di cambiare forma-allungare, accorciare e piegare-in risposta alla stimolazione elettrica, meccanica e chimica, una risposta motoria considerato cruciale per l&#39;amplificazione di segnali acustici cocleari 2. Stimolazione OHC induce due risposte diverse mobili: i) electromotility, alias motilità veloce, variazioni di lunghezza nel range microsecondo derivati ​​da cambiamenti conformazionali a trazione elettrica in proteine ​​motrici densamente OHC nella membrana plasmatica, e ii) la motilità lenta, cambia forma nel millisecondi a secondi gamma di riorganizzazione del citoscheletro 2, 3. OHC flessione è associato con electromotility, e il risultato sia da una distribuzione asimmetrica delle proteine ​​motrici nella membrana plasmatica laterale, o asimmetrica stimolazione elettrica di queste proteine ​​motore (ad esempio, con un campo elettrico perpendicolare all&#39;asse lungo delle cellule) 4. Stimoli meccanici e chimici inducono risposte mobili essenzialmente lento, anche se i cambiamenti nelle condizioni ionico delle cellule e / o del loro ambiente può anche stimolare la membrana plasmatica-embedded proteine ​​motrici 5, 6. Dal momento che le risposte OHC mobili sono una componente essenziale dell&#39;amplificatore cocleare, l&#39;analisi qualitativa e quantitativa di queste risposte mobili a frequenze acustiche (approssimativamente da 20 Hz a 20 kHz negli esseri umani) è una questione molto importante nel campo della ricerca dell&#39;udito 7. Lo sviluppo della nuova tecnologia di imaging ad alta velocità che unisce telecamere, sistemi basati su LED di illuminazione e sofisticati software di analisi dell&#39;immagine offre ora la possibilità di eseguire qualitativo affidabile e studi quantitativi della risposta mobili di OHC isolato in un campo elettrico alternato esterno (EAEF) 8. Questa è una tecnica semplice e non invasivo che aggira la maggior parte dei limiti degli approcci precedenti 9-11. Inoltre, il LED basato su sistema di illuminazione fornisce luminosità estrema con insignificanti effetti termici sui campioni e, per l&#39;uso della microscopia video, risoluzione ottica è di almeno 10 volte più alta rispetto alle tradizionali tecniche di microscopia ottica 12. Ad esempio, con l&#39;impostazione sperimentale descritta qui, variazioni di lunghezza delle cellule di circa 20 nm, possono essere regolarmente rilevati e affidabile a frequenze di 10 kHz, e questa risoluzione può essere ulteriormente migliorati a frequenze più basse. Siamo fiduciosi che questo approccio sperimentale contribuirà a estendere la nostra comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari alla base della motilità OHC.

Un metodo affidabile per studiare delle cellule esterne capelli (OHC) risposte di mobili, tra cui electromotility, motilità lenta e flessione, è descritto. Motilità OHC è provocato dalla stimolazione con un esterno di campo elettrico alternato, e il metodo si avvale di alte velocità di registrazione delle immagini, a base di illuminazione a LED, e l&#39;ultima generazione di software di analisi di immagine.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

Le OHC sono cellule sensomotorie cilindriche situate nell'organo del Corti, l'organo uditivo all'interno dell'orecchio interno dei mammiferi. Il nome "cellule ciliate" deriva...

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre un metodo affidabile per studiare le risposte motorie delle cellule ciliate esterne o OHC, inclusa l'elettromotilità, la motilità lenta e la flessione alle frequenze acustiche. Questo risultato si ottiene innanzitutto prelevando le ossa temporali da criceti, topi o altri animali mammiferi, e aprendo la bolla per esporre la coclea. Il secondo passaggio consiste nell'immergere la coclea in Lebovits L 15, rimuovendo la regione apicale della capsula ossea, il legamento spirale e la pagliuzza di vais, ed eliminando l'organo del Corti.Dopo un'incubazione di cinque minuti dell'organo del Corti in collagenasi ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro, questo viene trasferito nella camera di registrazione mediante una siringa Hamilton da 50 microlitri, e le cellule vengono dissociate passandole avanti e indietro attraverso l'ago. La camera di registrazione viene quindi posizionata sul microscopio per stimolare le cellule con un campo elettrico alternato esterno e registrare mediante videocamera ad alta velocità le risposte motili delle cellule ciliate esterne isolate. Infine, la elettromotilità, la motilità lenta e la flessione delle cellule ciliate esterne a frequenze acustiche possono essere valutate mediante analisi d'immagine assistita da computer.Iniziare questa procedura prelevando le ossa temporali da criceti, topi o altri modelli animali mammiferi. Quindi aprire le ossa temporali utilizzando pinzette adatte. Per esporre il coclea, rimuovere con attenzione l'osso in eccesso mantenendo intatto il rivestimento osseo del coclea e immergerlo in L-15 livi.Al microscopio, aprire la regione apicale della coclea. Rimuovere il dryer, i VASIs e il legamento spirale con la punta di una lama di bisturi, un ago microchirurgico o una pinzetta fine. Rimuovere l'organo del Corti dalla modiolo cocleare usando la pinzetta.Successivamente, posizionare il coclea in collaghenasi ad una concentrazione di un milligrammo per millilitro, a temperatura ambiente per cinque minuti. Se sono necessarie cellule ciliate dall'estremit&agrave; basale del coclea, rimuovere il rivestimento osseo che copre la base del coclea con il puntale e separare la spirale dall'osso temporale utilizzando la lama del bisturi. Prima di rimuovere l'organo del Corti, trasferire l'organo del Corti nella camera di registrazione utilizzando una siringa Hamilton da 50 microlitri. Quindi dissociare le cellule facendole passare ripetutamente attraverso l'ago.Di seguito è riportato lo schema del generatore di campo elettrico alternato esterno e dei collegamenti con il sistema di acquisizione delle immagini, i circuiti di controllo e il software appositamente implementato presso il nucleo ingegneristico dell'House Ear Institute. L'allestimento sperimentale utilizzato in questo esperimento comprende un microscopio invertito Axia vert 1 3 5 TV dotato di un sistema di illuminazione alternativo basato su LED e due micromanipolatori elettronici. Sono presenti tre report video sul microscopio: una fotocamera ultra veloce PhotoTron FastCam PCI X 10 24 controllata da PC nel teletrasporto, che offre un'elevata risoluzione e acquisisce immagini ad alte frequenze fino a 100.000 FPS.Le immagini fornite dalla telecamera ad alta velocità vengono osservate direttamente sul monitor del PC. Una telecamera CCD standard aggiuntiva, collegata al portello oculare, è connessa a un monitor ad alta risoluzione. Una fotocamera digitale convenzionale montata sul portello frontale permette l'acquisizione di singoli fotogrammi. Un software sviluppato in laboratorio, in esecuzione sullo stesso PC, controlla l'azionamento della telecamera ad alta velocità, il sistema di illuminazione e il campo elettrico alternato esterno.I due elettrodi, costituiti da due fili di argento del diametro di 0,25 millimetri con una distanza tra le punte di 0,8 millimetri montati su un micromanipolatore elettrico. Successivamente, calibrare il campo elettrico utilizzando un elettrodo esterno. Questo elettrodo misura il potenziale elettrico in diversi punti, generando una mappa del campo elettrico.Se una singola cellula ciliata esterna isolata viene posizionata tra le punte degli elettrodi con il suo asse longitudinale parallelo al campo elettrico alternato applicato, essa si muove allungandosi e accorciandosi alla stessa frequenza del campo elettrico. Ad esempio, qui viene mostrata una cellula stimolata a 50 hertz e registrata a 1000 fotogrammi al secondo. Questa immagine successiva mostra una cellula stimolata a quattro kilohertz e registrata a 18.000 fotogrammi al secondo.Se la cellula viene posizionata perpendicolarmente al campo, può essere osservato e analizzato un diverso tipo di flessione della cellula ciliata esterna. Questa cellula, ad esempio, si piega quando viene stimolata a 50 hertz con un campo elettrico perpendicolare al suo asse maggiore. Le cellule ciliate esterne possono mostrare variazioni di forma in risposta a stimolazioni non elettriche.Questa risposta è chiamata motilità lenta e può essere studiata anche con questa tecnica. Selezionare diverse stimolazioni tra i quattro protocolli differenti. Il primo è la frequenza singola continua.Si noti che è possibile selezionare la modalità di stimolo, la frequenza, l'ampiezza e il tipo di onda, che vengono indicati con cerchi rossi mediante il software di controllo fatto in casa. Il secondo protocollo di stimolazione è a frequenza singola a raffiche, in cui la durata delle raffiche e gli intervalli tra le raffiche sono regolabili. Il terzo è a scansione lineare, in cui le frequenze iniziale e finale sono regolabili.Il quarto protocollo di stimolazione è la stimolazione multipla, che permette la combinazione di diverse modalità di stimolo. Dopo aver selezionato i parametri corrispondenti, il software di controllo configura il sistema e consente all'operatore di avviare la registrazione video sincronizzata con la luce e la stimolazione cellulare cliccando un singolo pulsante sullo schermo del computer. In questo filmato, le cellule ciliate esterne isolate mostrano variazioni nella lunghezza o nella curvatura quando vengono stimolate con un campo elettrico alternato esterno parallelo o trasversale, rispettivamente, al loro asse longitudinale.Le risposte delle cellule ciliate esterne vengono analizzate in post-elaborazione utilizzando la funzione di tracciamento delle caratteristiche del software Pro Analysts. Qui è mostrata una cellula ciliata esterna stimolata a una frequenza di 50 hertz e registrata a 1000 fotogrammi al secondo. Il software fornisce la distanza tra due punti fotogramma per fotogramma, come mostrato qui durante l'accorciamento cellulare. La distanza tra i punti selezionati all'apice, indicato in rosso come piastra cuticolare, e alla base della cellula, indicata in verde come polo basale, è minore e aumenta con l'allungamento della cellula; il software esegue un'analisi fotogramma per fotogramma delle variazioni della lunghezza della cellula ciliata esterna.Il pannello nella parte inferiore dell'immagine mostra la traccia del movimento. In questo esempio, la lunghezza totale variabile è di circa 6,5 pixel. Di seguito è riportato un esempio che dimostra come il bordo della cellula possa essere rilevato e come l'area della sezione ottica possa essere misurata automaticamente mediante la funzione di tracciamento del contorno con il software pro analys.In questo esperimento, microsfere di polistirene vengono aggiunte in modo casuale e fissate saldamente alla membrana plasmatica nella soluzione di bagnatura. Diverse microsfere possono essere selezionate contemporaneamente e il software può seguirle automaticamente quadro per quadro. In questo modo, le cellule possono essere suddivise in sezioni e la motilità di ciascuna sezione può essere valutata in modo indipendente.Selezionando le microsfere localizzate ai margini laterali della cellula, è possibile valutare in modo indipendente le variazioni della lunghezza di ciascun segmento e le variazioni dell'angolo di un segmento rispetto all'altro. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre ore se realizzata correttamente.Ovviamente, è necessario del tempo aggiuntivo per l'analisi off-line dei filmati registrati. Tuttavia, con un software adeguato, questa analisi può essere completata in circa altre tre ore per ogni filmato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare le risposte motili delle cellule ciliate esterne, inclusa l'elettromotilità, la motilità lenta e la flessione alle frequenze acustiche.

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Whole-cell patch-clamp registrazioni da dendriti delle fibre nervose uditivo interno alla sinapsi nastro capelli cellule nella coclea di mammifero.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

Questo video dimostra la registrazione combinata dell'uscita afferente stimolata meccanicamente e dell'etichettatura del terminale nervoso nei follicoli piliferi di un padiglione auricolare di topo. Delinea le fasi coinvolte nella stimolazione meccanica dei terminali nervosi del follicolo pilifero prima e dopo l'esposizione a un colorante fluorescente a membrana, la registrazione elettrofisiologica dei potenziali d'azione generati e la visualizzazione dell'etichettatura del terminale nervoso...

Registrazione combinata dell'output afferente stimolato meccanicamente e della marcatura del terminale nervoso nei follicoli piliferi di topo

Fonte: Lukasz, D., et al. Imaging in vivo del calcio delle cellule ciliate della linea laterale in larve di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra l'imaging dal vivo dell'afflusso di calcio nelle cellule ciliate della linea laterale di una larva di pesce zebra transgenico paralizzata utilizzando un microscopio confocale. La stimolazione meccanica dei fasci di capelli tramite impulsi di fluido induce l'ingresso di calcio attraverso i canali di meccanotrasduzione e i canali...

Imaging della dinamica del calcio nelle cellule ciliate in linea laterale di larve di pesce zebra

Analisi della funzione delle cellule dei capelli vestibolare è complicata dalla loro posizione in profondità all'interno della parte più dura del cranio, l'osso temporale petroso. La maggior parte dei studi sulle cellule dei capelli funzionali hanno usato acutamente cellule ciliate isolate. Qui si descrive una preparazione semi-intatte di topo epitelio vestibolare per studi di microscopia elettrofisiologici e due fotoni.

Un isolato semi-intatte Preparazione del mouse vestibolare epitelio sensoriale di Elettrofisiologia e ad alta risoluzione microscopia a due fotoni

In questo studio, una tecnica dettagliata di microscopia ottica è stata ottimizzata per l'osservazione e l'analisi in tempo reale del movimento delle ciglia CPEC ex vivo insieme a un metodo di microscopia elettronica per l'analisi ultrastrutturale.

L&#39;osservazione del movimento ciliare delle cellule epiteliali del plesso coroide<em&gt; Ex Vivo</em

Viene presentata una tecnica semplice e innovativa per registrare le secrezioni afferenti dovute alla stimolazione meccanica dei terminali lanceolati delle terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio del topo.

Registrazione combinata di uscita meccanicamente stimolata afferenti ed nervo terminale Etichettatura in mouse follicolo pilifero lanceolate Endings

Qui descriviamo una nuova preparazione per l'imaging di terminali sensoriali lanceolati vivi di terminazioni a palizzata che innervano i follicoli piliferi della pelle dell'orecchio di topo durante la colorazione e la decolorazione con coloranti di stirylpyridinio.

Il monitoraggio ottico di Living nervo terminale Etichettatura nel follicolo pilifero lanceolate Endings del<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse Ear pelle

(Rana catesbeiana) sacculus del toro americana permette esame diretto della fisiologia delle cellule ciliate. Qui la dissezione e la preparazione del sacculus della rana toro per gli studi biofisici è descritto. Mostriamo esperimenti rappresentativi di queste cellule cigliate, incluso il calcolo di relazione forza-spostamento di un fascio e la misurazione del suo movimento non forzata.

Preparazione fisiologico delle cellule ciliate dalla sacculus del toro americana (<em&gt; Catesbeiana Rana</em&gt;)

Questo protocollo descrive i metodi per registrare la risposta uditiva del tronco cerebrale da cuccioli del ratto postnatale. Per esaminare lo sviluppo funzionale di cellule ciliate esterne, la procedura sperimentale del morsetto della intero-cellula patch registrazione in cellule ciliate esterne isolate è descritta passo dopo passo.

Risposta uditiva del tronco cerebrale ed esterna della cellula ciliata cellule intere Patch Clamp registrazione in ratti postnatali

Zebrafish è un sistema di modello che ha molte caratteristiche importanti, compreso chiarezza ottica, rapido sviluppo esterno e, di particolare importanza nel campo dell'udito e l'equilibrio, situato esternamente cellule ciliate sensoriali. Questo articolo descrive come transgenici zebrafish può essere utilizzato per analisi sia delle cellule cigliate mechanosensation e funzione presinaptica in toto.

Nel calcio in Vivo Imaging delle cellule ciliate linea laterale in Zebrafish larvale

Qui presentiamo un protocollo per la Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), una tecnica di scansione senza contatto che consente l'imaging su scala nanometrica di fasci di stereocilia in cellule ciliate uditive vive.

Stereocilia Bundle Imaging con risoluzione su scala nanometrica in cellule ciliate uditive di mammiferi vivi

Scopri un metodo affidabile per studiare la motilità delle cellule ciliate esterne utilizzando stimolazione elettrica alternata e analisi d'immagine ad alta velocità. Questa tecnica permette di valutare l'elettromotilità e la funzione cocleare.

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis (Video) | JoVE Journal

Indagare esterno motilità delle cellule dei capelli con una combinazione di stimolazione esterna alternata campo elettrico e ad alta velocità Image Analysis

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