Name: Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Scopri come generare epatociti funzionali da cellule staminali embrionali umane con efficienza del 90%. Questo metodo consente di studiare la biologia epatica in vitro e supportare la ricerca sul metabolismo dei farmaci.

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Il dottor Hay è stato sostenuto da una borsa di RCUK, il dottor West è stato sostenuto dal Dipartimento di Chirurgia, il dottor Medine è stata sostenuta da una sovvenzione del Fondo Nucleo BHF, il Sig. Baltasar Lucendo-Villarin è stata sostenuta da un dottorato di ricerca MRC Studenship. Il dottor Zhou è stato sostenuto da una borsa di studio dal governo cinese.

<ol><li>Asgari, S., Pournasr, B., Salekdeh, G. H., Ghodsizadeh, A., Ott, M., Baharvand, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+a+new+era+for+hepatology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology.</a> J. Hepatol. 53, 738-751 (2010).</li>
<li>Hay, D. C., Pernagallo, S., Diaz-Mochon, J. J., Medine, C. N., Greenhough, S., Hannoun, Z., Schrader, J., Black, J. R., Fletcher, J., Dalgetty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Screening+of+Polymer+Libraries+to+Define+Novel+Substrates+for+Functional+Hepatocytes+with+Inducible+Drug+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Unbiased Screening of Polymer Libraries to Define Novel Substrates for Functional Hepatocytes with Inducible Drug Metabolism.</a> Stem Cell Research. 6, 92-101 (2011).</li>
<li>Payne, C. M., Samuel, K., Pryde, A., King, J., Brownstein, D., Schrader, J., Medine, C. N., Forbes, S. J., Iredale, J. P., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+Functional+Hepatocyte+Like+Cells+in+Immune+Compromised+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+International%22%5BJournal%5D)">Persistence of Functional Hepatocyte Like Cells in Immune Compromised Mice.</a> Liver International. 31, 254-262 (2011).</li>
<li>Greenhough, S., Medine, C., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+Stem+Cell+Derived+Hepatocyte+Like+Cells+and+their+Potential+in+Toxicity+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocyte Like Cells and their Potential in Toxicity Screening.</a> Toxicology. 278, 250-255 (2010).</li>
<li>Medine, C. N., Greenhough, S., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Stem+Cell+Derived+Hepatic+Endoderm+in+Human+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">The Role of Stem Cell Derived Hepatic Endoderm in Human Drug Discovery.</a> Biochemical Society Transactions. 38, 1033-1036 (2010).</li>
<li>Hannoun, Z., Fletcher, J., Greenhough, S., Medine, C. N., Samuel, K., Sharma, R., Pryde, A., Black, J. R., Ross, J. A., Wilmut, I., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparison+between+Conditioned+Media+and+Serum+Free+Media+in+Human+Embryonic+Stem+Cell+Culture+and+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">The Comparison between Conditioned Media and Serum Free Media in Human Embryonic Stem Cell Culture and Differentiation.</a> Cellular Reprogramming. 12, 133-140 (2010).</li>
<li>Dalgetty, D. M., Medine, C., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+Future+Challenges+in+Stem+Cell-Derived+Liver+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Progress and Future Challenges in Stem Cell-Derived Liver Technologies.</a> American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, 241-248 (2009).</li>
<li>Hay, D. C., Fletcher, J., Payne, C., Terrace, J. D., Gallagher, R. C. J., Snoeys, J., Black, J., Wojtacha, D., Samuel, K., Hannoun, Z., Pryde, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Differentiation+of+hESCs+to+Functional+Hepatic+Endoderm+Requires+ActivinA+and+Wnt3a+Signalling%5BTitle%5D)+AND+%22+Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Differentiation of hESCs to Functional Hepatic Endoderm Requires ActivinA and Wnt3a Signalling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 12301-12306 (2008).</li>
<li>Fletcher, J., Cui, W., Samuels, K., Black, J. R., Currie, I. S., Terrace, J. D., Payne, C., Filippi, C., Newsome, P., Forbes, S. J., Ross, J. A., Iredale, J. P., Hay, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inhibitory+Role+of+Stromal+Cell+Mesenchyme+on+Human+Embryonic+Stem+Cell+Hepatocyte+Differentiation+is+Overcome+by+Wnt3a+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">The Inhibitory Role of Stromal Cell Mesenchyme on Human Embryonic Stem Cell Hepatocyte Differentiation is Overcome by Wnt3a Treatment.</a> Cloning and Stem Cells. 10, 331-340 (2008).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato un modello semplice, omogeneo e altamente riproducibili in vitro per generare livelli scalabili di HLCS umano. Il nostro modello è stato convalidato da una serie di laboratori esterni collaborazione. Noi abitualmente caratterizzano HLCS cellule staminali derivate usando il nostro strumento di casa nella casella dei marcatori dello sviluppo e del fegato analisi specifiche funzionali (la maggior parte dei quali sono disponibili in commercio). Le fasi critiche del nostro processo sono: il manten...

Lastre di verniciatura Matrigel e fiaschi <ol><li> Matrigel (10 ml, BD Biosciences, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Piastre di coltura tissutale (6 bene, ben 12, Corning, UK) </li><li> Tessuto fiasco cultura (25 cm2 ventilati, Corning, UK) </li></ol> hESC manutenzione <ol><li> Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> BSA soluzione (50 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li></ol> HESC Passaging con collagenasi <ol><li> Ben confluenti o fiasco di hESC. </li><li> Matrigel pozzi rivestiti o fiaschi a seconda dei casi. </li><li> Fosfato salina tamponata (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a temperatura ambiente. </li><li> Collagenasi IV (1 g, Gibco, InvitrOgen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Topo di medie fibroblasti embrionali condizionata (MEF-CM) (100 ml, R &amp; D Systems, USA). </li><li> Umano fondamentale fattore di crescita dei fibroblasti (100 mcg, Peprotech, USA). </li></ol> Differenziazione delle hESC a endoderma epatica <ol><li> RPMI 1640 (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Supplemento B27 (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Activin A (2 mg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Ricombinante Wnt3a del mouse (2 mg, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> KO-DMEM (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> KO-SR (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Aminoacidi non essenziali (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> β-mercaptoetanolo (10 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> DMSO (Sigma Aldrich, UK); conservare a temperatura ambiente </li><li> Leibovitz L-15 terreno di coltura (500 ml, SIGMuno Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Triptosio fosfato brodo (100 ml, Sigma Aldrich, UK); conservare a 4 ° C. </li><li> Siero fetale bovino, inattivato con il calore (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Idrocortisone 21-emisuccinato (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Insulina (pancreas bovino) (100 mg, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> L-Glutammina (100 ml, Gibco, Invitrogen, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Acido ascorbico (25 g, Sigma Aldrich, UK); conservare a -20 ° C. </li><li> Umano HGF (10 mcg, Peprotech, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Ricombinante umana oncostatina M (OSM) (50 mcg, R &amp; D Systems, USA); conservare a -20 ° C. </li><li> Siringa guidato unità filtro 0,22 micron (Millipore, UK) </li></ol> Caratterizzazione di Endoderma epatica derivati ​​dalle hESC Immunocolorazione <ol><li> Tampone fosfato salino (-MgCl 2,-CaCl 2) (500 ml, Gibco, Invitrogen, UK); STOre a temperatura ambiente. </li><li> PBST, PBS composto con 0,1% di Tween 20 (Sigma-Aldrich, UK). </li><li> Paraformaldeide (PFA) (Sigma-Aldrich, UK) è costituito in PBS, conservare a -20 ° C. </li><li> Glicerolo (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente. </li><li> Tris base (Sigma-Aldrich, UK), conservare a temperatura ambiente. </li><li> Etanolo </li><li> Siero (ABD Serotech, UK), conservare a -20 ° C. </li><li> Anticorpo secondario, Fluorofori Alexa (Molecular Probes, Invitrogen, UK). </li><li> MOWIOL 4-88 (Polysciences Inc, USA) è realizzata in Tris HCL e glicerolo come da istruzioni del produttore. DAPI (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK) è aggiunto alla soluzione MOWIOL a una diluizione 1:1000. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Anticorpi primari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Antigen * </td><td> Tipo </td><td> Fornitore </td><td> Diluizione </td></tr><tr><td> ALB </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> E-caderina </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Millipore </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> α-fetoproteina </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Sigma </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td> SSE-4 FITC </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> Biolegend </td><td> 1 / 100 </td></tr><tr><td> IgG </td><td> Monoclonali del mouse </td><td> DAKO </td><td> 1 / 500 </td></tr><tr><td colspan="2"> Anticorpi secondari </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-topo coniugato FITC </td><td> Capra monoclonali </td><td> Invitrogen </td><td> 1 / 400 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Gli anticorpi utilizzati per immunocolorazione epatiche derivate endoderma hESC, le concentrazioni utilizzate, la specie ha sviluppato nel e le società che essi siano acquistati. Analisi funzionale di Endoderma epatica e Normalisation (per mg di proteina) <ol><li> p4-GLO CYP3A4, CYP1A2, Kit e luminometro (Promega, USA). </li><li value="1"> Bianco fondo piatto piastra da 96 dosaggio bene (BD Biosciences, UK). </li><li> BCA Assay Kit (Pierce, Thermo Fisher Scientific, UK). </li><li> Trasparente piastra da 96 dosaggio bene (Iwaki, UK) </li></ol>

generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Nonostante i progressi nella modellazione tossicità dei farmaci umani, molti composti non durante gli studi clinici per effetti collaterali imprevisti. Il costo degli studi clinici sono notevoli, quindi è essenziale che più schermi tossicologia predittiva sono sviluppati e distribuiti nelle prime fasi di sviluppo dei farmaci (Greenhough et al 2010). Epatociti umani rappresentano il modello attuale gold standard per valutare la tossicità della droga, ma sono una risorsa limitata che presentano la funzione variabile. Pertanto, l&#39;uso di linee cellulari immortalizzate e modelli tessuti animali sono normalmente impiegati per la loro abbondanza. Mentre entrambe le fonti sono informativi, essi sono limitati dalla scarsa funzionalità, la variabilità delle specie e / o instabilità nella cultura (Dalgetty et al 2009). Le cellule staminali pluripotenti (PSC) sono una fonte interessante alternativa di epatociti umani come cellule (HLCS) (Medine et al 2010). PSC sono in grado di rinnovamento del sé e la differenziazione di tutti i tipi di cellule somatiche trovato negli adulti e, quindi, rappresentanouna fonte potenzialmente inesauribile di cellule differenziate. Abbiamo sviluppato una procedura che è semplice, altamente efficiente, suscettibili di automazione e rese funzionali HLCS umano (Hay et al 2008; Fletcher et al 2008; Hannoun et al 2010; Payne et al 2011 e Hay et al 2011). Crediamo che la nostra tecnologia porterà alla produzione scalabile di HLCS per la scoperta, la modellazione della malattia, la costruzione di dispositivi di extra-corporea e, eventualmente, le terapie cellulari a base di trapianto.

Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre livelli omogenei di epatociti umani per studiare la biologia del fegato umano in vitro. Questo viene avviato guidando le cellule staminali embrionali umane o le ESC umane verso l'endoderma definitivo utilizzando stimoli fisiologici attivi in A e WINT tre A.As un secondo passo l'endoderma definitivo è guidato in modo altamente efficiente verso l'endoderma epatico. Successivamente, l'endoderma epatico umano derivato da ESC viene maturato in vitro per produrre epatociti umani funzionali.I risultati della PCR Western blotting, dell'immunofluorescenza, della sindrome di Eliza e del metabolismo dei farmaci indicano che questo metodo deriva gli epatociti dalle ESC umane con un'efficienza di circa il 90%. Con questa tecnica, possiamo, in teoria, generare scorte inesauribili di epatociti umani primari, che mostrano livelli apprezzabili di funzionalità epatica umana. In futuro, ciò andrà a vantaggio di una previsione accurata della tossicità dei farmaci e fornirà supporto al fegato umano. Il trucco è quello di guidare la differenziazione solare e la densità del nucleo delle cellule umane.La dimostrazione visiva di questo meto

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Questo articolo si concentrerà sullo sviluppo di superfici polimeriche rivestite a lungo termine, coltura stabile di cellule staminali derivate epatociti umani.

Stabilizzazione epatocellulare Fenotipo Utilizzando superfici sintetiche ottimizzati

Il metodo presentato qui descrive una soluzione scalabile e buone pratiche di fabbricazione (GMP) sistema di differenziazione -ready per generare cellule epatociti-come l'essere umano da cellule staminali pluripotenti. Serve come un sistema economico e standardizzato per generare cellule epatociti-come l'essere umano per la ricerca di base e applicata fegato umano.

Definito e Generazione scalabile di cellule epatociti-come da cellule staminali umane pluripotenti

Il protocollo presentato qui descrive una piattaforma per identificare piccole molecole per il trattamento dell'affezione epatica. Una descrizione dettagliata è presentata dettagliare come differenziarsi iPSCs in cellule con le caratteristiche dell'epatocita in piastre da 96 pozzetti e per utilizzare le celle per schermo per piccole molecole con potenziale attività terapeutica.

Utilizzando umani indotti dell'epatocita-come di derivati da cellule staminali pluripotenti per scoperta della droga

Questo protocollo descrive un approccio semi-automatizzato per produrre dell'epatocita-come le cellule da cellule staminali pluripotenti umane in un formato ben 96 PORTATARGA. Questo processo è rapido ed economico, permettendo che la produzione di qualità ha assicurato lotti dell'epatocita-come delle cellule per la ricerca umana di base e applicata.

Produzione semi-automatizzata di Hepatocyte come cellule staminali pluripotenti

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

Questo protocollo descrive un approccio per produrre epatosfere da cellule staminali pluripotenti umane utilizzando un sistema di coltura definito e l'autoassemblaggio delle cellule. Questo protocollo è riproducibile in un certo numero di linee cellulari, conveniente e consente la produzione di epatosfere umane stabili per l'applicazione biomedica.

Produzione senza siero di epofere umane tridimensionali da cellule staminali pluripotenti

L'obiettivo di questo articolo è quello di fornire un approccio standardizzato per indurre la differenziazione del progenitore epatico umano dalle cellule staminali pluripotenti. Lo sviluppo di questa procedura con formulazioni di media pronti all'uso offre all'utente un sistema facile per generare cellule epatiche umane per la ricerca e la traduzione biomedica.

Specifica del progenitore epatico da cellule staminali pluripotenti utilizzando un sistema di differenziazione definito

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in cellule funzionali simili a epatociti (HHC) completando continuamente Activin A e CHIR99021 durante la differenziazione hESC in endoderma definitivo (DE).

Un metodo efficiente per l'induzione di cellule simili a epatociti diretti da cellule staminali embrionali umane

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

I sistemi di differenziazione da cellule staminali pluripotenti (PSC) a cellule funzionali sono attualmente ostacolati da problemi di grave variabilità da linea a linea e da lotto a lotto. Qui, utilizzando la differenziazione cardiaca come esempio principale, presentiamo un protocollo per monitorare e modulare in modo intelligente il processo di differenziazione della PSC basato sull'apprendimento automatico basato su immagini.

Una strategia di apprendimento automatico basata su immagini di cellule vive per monitorare la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti

Scopri come generare epatociti funzionali da cellule staminali embrionali umane con efficienza del 90%. Questo metodo consente di studiare la biologia epatica in vitro e supportare la ricerca sul metabolismo dei farmaci.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

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