Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre livelli omogenei di epatociti umani per studiare la biologia del fegato umano in vitro. Questo viene avviato guidando le cellule staminali embrionali umane o le ESC umane verso l'endoderma definitivo utilizzando stimoli fisiologici attivi in A e WINT tre A.As un secondo passo l'endoderma definitivo è guidato in modo altamente efficiente verso l'endoderma epatico. Successivamente, l'endoderma epatico umano derivato da ESC viene maturato in vitro per produrre epatociti umani funzionali.

I risultati della PCR Western blotting, dell'immunofluorescenza, della sindrome di Eliza e del metabolismo dei farmaci indicano che questo metodo deriva gli epatociti dalle ESC umane con un'efficienza di circa il 90%. Con questa tecnica, possiamo, in teoria, generare scorte inesauribili di epatociti umani primari, che mostrano livelli apprezzabili di funzionalità epatica umana. In futuro, ciò andrà a vantaggio di una previsione accurata della tossicità dei farmaci e fornirà supporto al fegato umano. Il trucco è quello di guidare la differenziazione solare e la densità del nucleo delle cellule umane.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la densità cellulare centrale è essenziale per generare una popolazione cellulare omogenea. Abbiamo formato oltre 15 persone in quattro siti a livello internazionale per eseguire con successo questa tecnica. Iniziare con una coltura di cellule staminali embrionali umane e propagarle su piastre rivestite di matrigel con fibroblasti embrionali di topo condizionati con terreno ORM cm integrato con FGF basico.

È importante caratterizzare attentamente le cellule staminali embrionali umane mantenute prima della differenziazione epatica. Ad esempio, queste cellule mostrano una morfologia ESC umana. Esprimono anche i marcatori delle cellule staminali pluripotenti, OCT four e nano in livelli paragonabili alla linea di ESC umana H seven di controllo positivo.

Inoltre, gli ESC umani sono positivi per SS EEA quattro. Quando le ESC umane raggiungono il 30-60% di cofluenza, sostituire il ME CM con un terreno di differenziazione appena preparato. Per avviare la differenziazione epatica, il terreno deve essere sostituito ogni 24 ore per tre giorni.

Dopo tre giorni, le cellule assumono un aspetto triangolare quando iniziano a differenziarsi verso un fenotipo endodermico. Cambia la differenziazione da media a SR DMSO. Coltura media per quattro o cinque giorni.

Sostituzione del fluido ogni 48 ore. Dopo questo periodo di cinque giorni, le cellule avrebbero iniziato ad assumere un aspetto poligonale caratteristico delle cellule epatiche. La differenziazione delle ESC umane nell'endoderma epatico si riflette in una serie di profondi cambiamenti morfologici entro il nono giorno.

Inoltre, l'espressione di Octa four nel corso dei nove giorni diminuisce progressivamente. Al contrario, i trascritti epatici di una FP e albumina aumentano dal settimo giorno in poi. Continuare maturando le cellule e mantenendo il fenotipo epatico nel terreno finale per nove giorni con terreno fresco ogni 48 ore.

Infine, monitorare le cellule in coltura mediante microscopia a contrasto di fase per rilevare cambiamenti morfologici graduali da una forma triangolare appuntita a una caratteristica morfologia epatica che mostra un aspetto poligonale per valutare quantitativamente il saggio della funzione dell'endoderma epatico. Per l'attività enzimatica del citocromo P quattro 50, in particolare SIP tre A quattro o SIP uno A due. Primo giorno di incubazione 17.

Cellule endodermiche epatiche derivate da ESC umane con il substrato specifico che esegue reazioni in triplicati. Ricordarsi di utilizzare i terreni di coltura tissutale come controllo negativo: incubare a 37 gradi Celsius per cinque ore. Raccogliere i surnatanti e misurare i livelli relativi di attività enzimatica basale come descritto nelle istruzioni del produttore.

Ora, per ogni campione, calcola l'attività enzimatica per milligrammo di proteina come determinato da A-B-C-A-S. Una colorazione immunologica di colture tipiche derivate da questo metodo di maturazione in vitro dell'endoderma epatico. Dimostrare l'espressione omogenea di tre marcatori epatici umani, albumina a FP ed ein.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come differenziare in modo efficiente le cellule staminali umane e di apprendimento in epatociti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita quotidianamente con un impegno di circa due minuti e mezzo per milione di cellule. È molto importante controllare quotidianamente i cambiamenti morfologici durante il processo di differenziazione.