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0 visualizzazioni • 4:13 min. • April 30th, 2023
Le cellule tumorigeniche delle tube di Falloppio stimolano le cellule ovariche sane a produrre comunicatori chimici o piccole molecole che promuovono le metastasi tumorali. Per visualizzare questi comunicatori chimici, inizia assemblando un divisorio per pozzetti sopra un vetrino adatto. Posizionare un divisorio di plastica in diagonale nel pozzetto per separare il pozzetto in due scomparti di uguali dimensioni. Erogare una sospensione di cellule tumorali delle tube di Falloppio in agarosio liquido in un compartimento del pozzetto. Dopo il raffreddamento, l'agarosio si solidifica e forma una rete 3D che consente l'intrappolamento delle cellule tumorali.
Rimuovere il divisorio e posizionare un tessuto ovarico sano al centro dello scomparto vuoto. Copritela con una miscela liquida di agarosio. Lasciare che l'agarosio si solidifichi e incorpori il tessuto ovarico in prossimità delle cellule tumorali. Incubare per la durata desiderata. Sia le cellule tumorali che le cellule ovariche sane producono piccole molecole che si diffondono attraverso la rete di agarosio verso le cellule vicine.
Rimuovere il divisore del pozzo. Essiccare la co-coltura per essiccare e appiattire l'agar e catturare le piccole molecole rilasciate all'interno della matrice. Visualizza la distribuzione di piccole molecole utilizzando la spettroscopia di massa per immagini o IMS.
Posizionare il divisore a 8 pozzetti sopra il vetrino trattato con ITO e inserire i divisori di plastica in diagonale nei pozzetti. Preparare le colture cellulari come fatto in precedenza e unire 100 microlitri di sospensione cellulare e 100 microlitri di agarosio liquefatto in una provetta da 2 millilitri. Immediatamente, impiattare 150 microlitri di miscela di agarosio cellulare su un lato del divisore, mantenendo la pressione verso il basso sul divisore.
Lasciare raffreddare e solidificare l'agarosio per circa 1 minuto, quindi rimuovere il divisore. Usa una pinza per posizionare l'espiantante di ovaie al centro della metà vuota del pozzetto. Aggiungere 150 microlitri di miscela di agarosio cellulare sopra l'ovaio. Incubare il vetrino a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore umidificato.
Dopo quattro giorni, rimuovere il divisore della camera dai tappi di agarosio. Con una spatola piatta, staccare i lati dell'agarosio dalla camera e tirare delicatamente la camera verso l'alto. Se vengono spostati dei tappi di agarosio, riposizionarli delicatamente in modo che non si tocchino l'un l'altro.
Posizionare il vetrino in un forno a 37 gradi Celsius per circa quattro ore e ruotare di 90 gradi ogni ora per garantire una distribuzione uniforme del calore in tutto il campione. Il vetrino deve essere completamente asciutto; in caso contrario, potrebbe portare ad un'esplosione del campione nell'ambiente di alto vuoto dello spettrometro di massa MOLDI-TOF.
L'asciugatura del vetrino e il monitoraggio dell'avanzamento sono il passaggio più critico per ottenere un'elevata risoluzione spaziale e spettri di massa di qualità. Se si verificano desquamazione o rughe eccessive, si sconsiglia di raccogliere i dati della spettrometria di massa.
Con i parametri impostati sullo spruzzatore a matrice, applicare la soluzione a matrice sul vetrino. Per utilizzare il rosso fosforo come calibrante, aggiungere 1 microlitro di rosso fosforo in un punto chiaro sul vetrino. Per utilizzare la miscela di peptidi come calibrante, mescolarla con la matrice sul parafilm in un rapporto 1 a 1 per favorire la ionizzazione e posizionare 0,5 a 1 microlitro sul vetrino. Attendere che il calibratore si asciughi prima di acquisire i dati della spettrometria di massa per l'imaging.