Sistema di coltura prossimale: una tecnica di coltura in vitro per studiare la segnalazione paracrina tra le cellule

Nella segnalazione paracrina, le cellule producono e secernono molecole di segnalazione che inducono risposte nelle cellule vicine. Per imitare la segnalazione paracrina, iniziare preparando sospensioni unicellulari di cellule tumorali ovariche e cellule mesoteliali nel loro terreno appropriato.

Quindi, prendi un inserto membranoso poroso invertito in una piastra di coltura sterile. Pipet la sospensione di cellule tumorali sulla superficie inferiore della membrana dell'inserto per formare una cupola liquida. Incubare per consentire alle cellule di stabilirsi e attaccarsi alla membrana.

Capovolgere l'inserto per drenare il supporto. Trasferire l'inserto in una piastra di coltura fresca contenente terreni di coltura per nutrire le cellule tumorali aderenti alla superficie inferiore della membrana. Ora, aggiungere la sospensione di cellule mesoteliali nel pozzetto dell'inserto. Incubare per consentire alle cellule di aderire al lato opposto della membrana, negando qualsiasi contatto diretto tra i due tipi di cellule.

Durante la coltura, entrambi i tipi di cellule secernono fattori di segnalazione. Queste molecole si diffondono attraverso la membrana porosa verso le cellule vicine. Si legano a specifici recettori cellulari e inducono complesse cascate di segnalazione in entrambi i tipi di cellule.

Inizia staccando le cellule del cancro ovarico da una miscela confluente all'80% con 1 millilitro di tripsina allo 0,25% per 40-60 secondi, seguita dalla neutralizzazione della reazione con 6 millilitri di terreno di crescita completo. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere il pellet in 5 millilitri di terreno di coltura fresco completo.

Dopo il conteggio, diluire le cellule a 100.000 cellule di cancro ovarico per millilitro di concentrazione completa del terreno di crescita e posizionare tre inserti di coltura cellulare con membrana in policarbonato trattati con colture di tessuti a pori invertiti da 0,4 micrometri per condizione sperimentale in una piastra di coltura tissutale sterile di dimensioni adeguate. Etichettare gli inserti in base alle condizioni sperimentali e pipettare con cura le cellule tumorali sul fondo di ciascun inserto in cerchi concentrici, partendo dal centro della membrana e spostandosi verso l'esterno, per formare una cupola da 800 microlitri.

Prestare la massima attenzione quando si seminano le cellule sulla superficie inferiore dell'inserto, in modo che la cupola delle cellule contenenti il terreno non fuoriesca dai bordi dell'inserto durante l'incubazione.

Quando tutti gli inserti sono stati seminati, coprire il piatto e posizionare con cura gli inserti nell'incubatore per colture cellulari. Dopo circa 4 ore, staccare l'HPMC con 2 millilitri di tripsina allo 0,25% per uno o due minuti, seguiti dalla neutralizzazione della reazione con 12 millilitri di terreno di coltura completo.

Raccogliere l'HPMC mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno di crescita completo per il conteggio. Diluire le cellule a 300.000 HPMC per millilitro di terreno di crescita completo e aggiungere 2,5 millilitri di terreno di crescita completo fresco a ciascun pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti.

Utilizzando una pinza sterile, posizionare ciascun inserto con il lato destro rivolto verso l'alto in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti in modo che le superfici attaccate alle cellule di cancro ovarico inferiori siano immerse nel terreno. Quindi, seminare 1,5 millilitri di HPMC nel pozzetto di ciascun inserto e posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 72 ore.

• Paracrine Signaling - Cellular communication through secreted molecules affecting neighboring cells.
• Mesothelial Surface - The membrane where the mesothelial cells adhere and function.
• Culture System - Set-up where cells are grown under controlled conditions, often in vitro.
• Corning 10-013-CV - Specific type of culture dish used for cell adhesion and growth experiments.
• In Vitro Cell Culture Techniques - Methods used to cultivate cells in controlled environments outside of the living organism.

• Introduce Paracrine Signaling – Paracrine signaling is the process by which cells communicate and influence the behavior of neighboring cells via secreted molecules (e.g., paracrine).
• Key Concepts - We can simulate this biological process in an in vitro cell culture system using human mesothelial cells and cancer cells (e.g., culture system).
• Underlying Mechanisms - Both cell types secret signaling factors which bind to receptors and trigger complex responses (e.g., mesothelial surface).
• Connect to Experiment - To study this, cells are cultivated on either side of a porous membrane in a culture dish (e.g., corning 10-013-CV).

• What is paracrine signaling and how does it work in an in vitro culture system?
• How are mesothelial and cancer cells cultured for this study?
• What are the key concepts and mechanisms underlying paracrine signaling?

• Practical Applications - Understanding paracrine signaling could improve diagnosis and treatment of diseases like cancer (e.g., in vitro cell culture techniques).
• Industry Impact - The knowledge acquired is beneficial for the medical and pharmaceutical sectors (e.g., culture system).
• Societal Importance - The broader implications extend to improving patient outcomes and quality of care (e.g., mesothelial surface).
• Link to Scientific Advancements - The use of in vitro cultivation techniques continues to advance our understanding of cell communication (e.g., corning 10-013-CV).