Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

Il peritoneo, o la membrana che riveste la cavità addominale, costituisce cellule mesoteliali peritoneali sostenute da uno strato di tessuto connettivo fibrovascolare. Le cellule di cancro ovarico metastatizzanti aderiscono a questo rivestimento peritoneale e proliferano in escrescenze cancerose.

Per modellare le metastasi del cancro ovarico, inizia prendendo i fibroblasti umani in un tubo conico e mescolali con il collagene, una proteina della matrice extracellulare. Placcare la sospensione su un piatto di coltura. Incubare per facilitare la solidificazione della matrice di collagene per incorporare i fibroblasti e imitare il tessuto connettivo del peritoneo.

Successivamente, aggiungi una sospensione di cellule mesoteliali sullo strato di collagene dei fibroblasti. Incubare la piastra per consentire alle cellule mesoteliali di aderire e formare un monostrato sulla superficie dello strato di fibroblasto-collagene. Questa coltura organotipica 3D ora imita la composizione e l'architettura di un rivestimento peritoneale in vivo.

Infine, seminare questa coltura organotipica con cellule di cancro ovarico e incubare per la durata desiderata. Le cellule tumorali ovariche rilasciano alcune molecole di segnalazione che alterano lo strato mesoteliale, migliorando l'adesione e l'invasione delle cellule tumorali, imitando le condizioni metastatiche in vivo.

Per rilasciare i normali fibroblasti dell'omento dalla coltura, sciacquare il pallone di coltura con 10 millilitri di PBS seguiti da 3 millilitri di tripsina per non più di 5 minuti. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con almeno tre volte il volume del mezzo di crescita completo e trasferire le cellule in un tubo conico da 50 millilitri. Abbassare le celle e risospendere il pellet in 5 millilitri di terreno di crescita completo. Quindi, contare le cellule e diluirle a 2-4 volte 10 al terzo fibroblasto per 100 microlitri di piena concentrazione del terreno di crescita.

Quindi, aggiungere 0,5 microgrammi per 100 microlitri di collagene I a coda di topo alle cellule e placcare 100 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra nera e trasparente a fondo 96 pozzetti. Quindi, trasferire la piastra in un incubatore per colture cellulari per almeno 4 ore o fino a quando le cellule non aderiscono alla superficie della piastra. Mentre i normali fibroblasti dell'omento si stanno depositando, staccare l'HPMC dai loro flaconi di coltura e diluire queste cellule da 1 a 2 volte 10 al quarto HPMC per 50 microlitri di terreno di crescita completo.

Quindi, aggiungere 50 microlitri di HPMC per pozzetto ai normali fibroblasti dell'omento attaccati e rimettere la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno 18 ore prima dell'uso sperimentale. Il giorno successivo, seminare le co-colture organotipiche 3D con cellule di cancro ovarico che esprimono GFP da una coltura confluente dall'80% al 90% alla diluizione appropriata per il test a valle desiderato.