Isolamento delle cellule mesoteliali: una tecnica per isolare le cellule mesoteliali primarie da un campione di tessuto di omento umano

Le cellule mesoteliali primarie umane, o HPMC, rivestono molti organi viscerali come l'omento o lo strato di tessuto adiposo presente nella cavità peritoneale.

Per isolare le cellule mesoteliali, iniziare immergendo un campione di omento umano in un tampone adatto per rimuovere i globuli rossi o i globuli rossi in eccesso. Quindi, metti l'omento in un piatto di vetro e tritalo a pezzi. Questo dissocia il tessuto, rilasciando HPMC insieme ai globuli rossi contaminanti.

Trasferite i pezzi in un tubo conico e lasciateli riposare per il tempo desiderato. Il tessuto tritato ricco di grasso a bassa densità sale verso l'alto, mentre i componenti cellulari densi si depositano sul fondo. Quindi, aspirare il liquido sul fondo, contenente HPMC e RBC, in una nuova provetta.

Centrifuga per raccogliere le cellule. Rimuovere il surnatante contenente tampone. Risospendere il pellet in un terreno di coltura mesoteliale e incubare per la durata desiderata. Il terreno facilita la crescita selettiva degli HPMC rispetto ai globuli rossi.

Osserva le cellule usando un microscopio ottico per confermare la crescita delle cellule mesoteliali umane di forma cuboidale.

Dopo l'acquisizione di un campione chirurgico di omento umano, immergere immediatamente il campione in PBS a temperatura ambiente. Entro 2 ore dall'immersione, trasferire l'omento in una provetta conica da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS fresco. Trasferire il restante lavaggio di PBS contenente le cellule mesoteliali umane primarie o HPMC e i globuli rossi in una nuova provetta conica da 50 millilitri e far girare le cellule.

Quindi, versare il contenuto della provetta in un piatto di coltura sterile da 10 centimetri e utilizzare due bisturi per tritare il tessuto in pezzi da 5 millimetri cubi. Per isolare le cellule mesoteliali umane primarie o HPMC, trasferire i pezzi di omento in una provetta conica da 50 millilitri e attendere 1 minuto affinché i pezzi solidi galleggino verso l'alto. L'HPMC si depositerà sul fondo della provetta con i globuli rossi.

Utilizzare una pipetta per trasferire il lavaggio PBS contenente cellule mesoteliali e globuli rossi nella provetta contenente le cellule pellettate e centrifugare le cellule. Quindi, aggiungere 20 millilitri di PBS fresco all'omento e raccogliere l'HPMC e l'RBC contenenti PBS altre tre volte, come appena dimostrato dalle celle pellettizzate originali.

Dopo la centrifuga finale, impiattare le cellule in un pallone da 75 centimetri quadrati in 15 millilitri di terreno di crescita completo. Per isolare ulteriore HPMC dal campione di omento, agitare il tessuto solido rimanente in 20 millilitri di PBS a 200 giri/min e 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, lasciare riposare il campione per 1 minuto per consentire al tessuto solido di salire verso la parte superiore della provetta.

Quindi, raccogliere l'HPMC e l'RBC dal fondo del tubo come appena dimostrato. Ora, centrifugare le cellule dal lavaggio secondario e piastrerle in un pallone separato da 75 centimetri quadrati in 15 millilitri di terreno di crescita completo. Per isolare l'eventuale HPMC rimasto, agitare il tessuto per altri 10 minuti, questa volta in una miscela di PBS e 10 millilitri di tripsina-EDTA, e placcare questi HPMC e RBC in un pallone da 75 centimetri quadrati.

Quindi, incubare le colture a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un ambiente umidificato. Nutrire le cellule piastrate con 15 millilitri di terreno di coltura fresco e completo nei giorni 3 e 5 senza rimuovere il terreno esaurito. Le HPMC possono essere identificate dalla loro forma cuboidale e dalla loro espressione di citocheratina-8 e vimentina.