Saggio di clearance mesoteliale: una tecnica in vitro per quantificare la capacità di invasione degli sferoidi del cancro ovarico nei monostrati di cellule mesoteliali

0 visualizzazioni4:34 min • April 30th, 2023

Durante le metastasi del cancro ovarico, le cellule maligne si staccano dal sito del tumore primario e iniziano a circolare all'interno della cavità peritoneale. Queste cellule possono quindi formare grappoli o sferoidi che aderiscono al monostrato di cellule mesoteliali che riveste la cavità peritoneale. Man mano che il tumore cresce, elimina le cellule mesoteliali sottostanti per facilitare l'invasione.

Per modellare la clearance mesoteliale, iniziare seminando cellule mesoteliali che esprimono la proteina fluorescente verde o GFP in un piatto di coltura con fondo di vetro rivestito di fibronectina. Il rivestimento di fibronectina fornisce una matrice che favorisce l'adesione cellulare. Incubare la capsula per consentire alle cellule mesoteliali di diffondersi e formare un monostrato.

Successivamente, trasferire una sospensione di sferoidi di cellule tumorali ovariche che esprimono la proteina fluorescente rossa sul monostrato mesoteliale. Visualizzare la coltura per una durata prolungata utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Gli sferoidi rosso-fluorescenti si depositeranno e si attaccheranno al monostrato mesoteliale verde-fluorescente.

Le cellule tumorali esercitano una forza sulle cellule mesoteliali, interrompendo le giunzioni cellulari e alterando l'integrità dello strato mesoteliale. La forza sposta anche le cellule mesoteliali sottostanti, generando un buco. Scegliere un'impostazione appropriata del filtro GFP per visualizzare il foro risultante come uno spazio nero nell'immagine. Misurare lo spazio per quantificare l'entità della clearance mesoteliale.

Per iniziare questa procedura, pre-rivestire i pozzetti di una capsula MatTek a 6 pozzetti con fondo di vetro con fibronectina. Aggiungere 2 millilitri di soluzione di fibronectina/PBS a ciascun pozzetto della capsula e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Le cellule mesoteliali fluorescenti verdi che esprimono proteine, per formare un monostrato di cellule mesoteliali, vengono coltivate in terreno basico al 10%. Tripsinizzare una piastra di cellule mesoteliali e farla girare in una centrifuga da tavolo a 900 giri/min per tre minuti.

Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in terreno basico al 10%. Regolare alla concentrazione desiderata con il 10% di terreno di base. Al termine dell'incubazione di 30 minuti della fibronectina della piastra MatTek, lavare i pozzetti con 2 millilitri di PBS. Aspirare il PBS e la piastra 6 volte 10 alla quinta cella mesoteliale per pozzetto in ciascun pozzetto della capsula MatTek a 6 pozzetti. Incubare la piastra MatTek in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius durante la notte per consentire alle cellule mesoteliali di attaccarsi alla piastra e formare un monostrato.

Utilizzare una pipetta per raccogliere gli sferoidi del cancro ovarico dalla piastra rivestita in poli-HEMA a 96 pozzetti. Aspirare il terreno da un pozzetto della piastra MatTek a 6 pozzetti contenente un monostrato di cellule mesoteliali. Lavare una volta con 2 millilitri di PBS. Aggiungere tutti gli sferoidi dalla piastra a 96 pozzetti a un pozzetto della piastra MatTek. Questo è circa tre volte il numero di sferoidi che verranno ripresi per tenere conto degli sferoidi che atterrano sulla parte della parabola che non può essere visualizzata.

Poiché vogliamo visualizzare un solo sferoide per campo visivo, l'aggregazione degli sferoidi deve essere evitata. Scuotere delicatamente il piatto da un lato all'altro per distribuire uniformemente gli sferoidi sul monostrato prima che si attacchino.

Posizionare la parabola MatTek sul tavolino di un microscopio a fluorescenza a campo largo invertito in grado di eseguire l'imaging time-lapse per la durata di almeno otto ore. Utilizza un tavolino motorizzato per visualizzare più posizioni nella parabola, con più eventi di intercalazione sferoidale, in un unico esperimento. Gli sferoidi delle cellule tumorali ovariche si depositeranno sul fondo del piatto e si attaccheranno al monostrato di cellule mesoteliali. Raccogli immagini GFP, RFP e di fase di oltre 20 interazioni sferoidi/monostrato ogni dieci minuti per otto ore.

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Ultimo aggiornamento: 29 agosto 2026