Saggio di spin down dell'agarosio: una tecnica per incorporare organoidi per l'analisi istologica

Le colture 3D di organoidi di cellule tumorali ricapitolano molte caratteristiche fisiopatologiche dei tumori umani. Pertanto, queste colture in vitro costituiscono un modello eccellente per la ricerca sul cancro.

Per la lavorazione di questi organoidi, iniziare con una coltura di organoidi 3D preformati cresciuti in un'adeguata matrice di membrana basale. Aggiungere il terreno di recupero cellulare desiderato e incubare. Il mezzo facilita la depolimerizzazione del gel della matrice, rilasciando gli organoidi 3D nella soluzione.

Centrifugare questa miscela per pellettizzare gli organoidi. Il terreno di recupero contenente i componenti della matrice rimane nel surnatante. Scartare il surnatante. Quindi, aggiungere la soluzione di paraformaldeide al pellet dell'organoide. La sostanza chimica entra nelle cellule organoidi e si lega agli amminoacidi, causando la reticolazione delle proteine e la fissazione del campione. Questo passaggio è fondamentale per qualsiasi applicazione istologica a valle.

Pellettizzare gli organoidi per separare e rimuovere il surnatante contenente paraformaldeide. Aggiungere l'agarosio fuso caldo agli organoidi. Utilizzare un ago per staccare e disperdere gli organoidi pellettati nell'agarosio liquido. Lasciare solidificare l'agarosio e incorporare gli organoidi. Utilizzare il tappo di agarosio contenente organoidi per i saggi istologici a valle.

Per processare gli organoidi per l'istologia, rimuovere i terreni esistenti dal pozzetto facendo attenzione a non aspirare le cupole della membrana basale. Aggiungere un volume uguale di soluzione di recupero cellulare e incubare la piastra per 60 minuti a 4 gradi Celsius.

Dopo l'incubazione, rimuovere la cupola della membrana basale utilizzando una pipetta e schiacciarla con la punta della pipetta. Raccogliere la cupola dissociata e la soluzione di recupero cellulare in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 300 x g e 4 gradi Celsius per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante e metterlo da parte.

Conservare tutto il surnatante fino allo step finale quando la presenza di organoidi è confermata. Aggiungere il volume desiderato di PBS freddo e pipettare delicatamente su e giù per rimuovere meccanicamente il pellet senza interrompere gli organoidi. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.

Fissare il pellet in un volume corrispondente di PFA al 4% per 60 minuti a temperatura ambiente. Dopo il fissaggio, ripetere la fase di centrifugazione e il lavaggio PBS. Quindi, aggiungere lentamente 200 microlitri di agarosio caldo al 2% e staccare immediatamente ma delicatamente il pellet cellulare dalla parete del tubo senza interromperlo utilizzando un ago calibro 25 collegato a una siringa da 1 millilitro.

Per il metodo spin down dell'agarosio, è fondamentale staccare il pellet cellulare dalla parete del tubo subito dopo aver aggiunto l'agarosio utilizzando un ago calibro 25.

Una volta che l'agarosio si è completamente solidificato, staccarlo dal tubo con un ago da 25 gauge attaccato a una siringa da 1 millilitro e trasferirlo in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Riempire la provetta con etanolo al 70% e procedere con il protocollo convenzionale per la disidratazione dei tessuti e l'inclusione di paraffina.

• Spin-down - A process to separate substances of different densities by centrifugation.
• Organoid paraffin embedding - A technique to preserve biological tissues in paraffin wax.
• Cell recovery solution - A solution used to dissociate cells from a matrix for further analysis.
• Agar embedding - A method to preserve tissue samples in an agarose gel block.
• Agarose embedding protocol - A detailed procedure for encasing biological samples in agarose.

• Introduce Spin-down – A method utilized to separate different-density particles by centrifugal force (e.g., spin-down).
• Key Concepts – Overview of tissue sample preservation techniques such as paraffin and agar embedding (e.g., organoid paraffin embedding).
• Underlying Mechanisms – Description of the procedure to detach and process organoids (e.g., cell recovery solution).
• Connect to Experiment – Explanation of the importance of proper organoid and agarose handling in the experiment.

• What is the spin-down technique and how is it applied in the procedure?
• How does organoid paraffin embedding contribute to tissue preservation?
• What role does cell recovery solution play during the dissociation of organoids?

• Practical Applications – Spin-down and embedding techniques in biological and medical research (e.g., spin-down).
• Industry Impact – Areas like pathology and histology benefit from these methods (e.g., organoid paraffin embedding).
• Societal Importance – Advancement in disease diagnosis and treatment (e.g., cell recovery solution).
• Link to Scientific Advancements – Development of improved tissue preservation and analysis methods.