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0 visualizzazioni • 3:28 min. • April 30th, 2023
Per valutare la chemioresistenza nelle cellule tumorali, iniziare prendendo una piastra a più pozzetti. Seminare una sospensione delle cellule tumorali della prostata sensibili ai farmaci desiderate in alcuni pozzetti e una sospensione della variante resistente ai farmaci delle cellule nei pozzetti rimanenti.
Incubare la coltura per facilitare l'adesione delle cellule alla piastra di coltura. Trattare entrambi i tipi di cellule con una gamma di dosi crescenti della soluzione farmacologica selezionata. Le molecole del farmaco entrano nelle cellule sensibili e causano la morte cellulare anche alle loro concentrazioni più basse. Tuttavia, le cellule resistenti espellono le molecole del farmaco attraverso pompe specializzate per l'efflusso del farmaco, consentendo la loro sopravvivenza nonostante siano esposte a concentrazioni di farmaco più elevate.
Aspirare il terreno esaurito contenente detriti e soluzione farmacologica. Integrare con terreni di crescita freschi e privi di farmaci. Incubare per consentire alle cellule resistenti ai farmaci sopravvissute di proliferare e formare colonie. Aggiungere una soluzione colorante adatta per colorare le colonie di cellule vive.
Lavare la coltura per rimuovere il colorante in eccesso. Conta il numero di colonie colorate in ogni pozzetto. I pozzetti contenenti cellule sensibili ai farmaci contengono pochissime colonie vitali. Al contrario, i pozzetti contenenti cellule resistenti ai farmaci mostrano un numero maggiore di colonie. Tuttavia, queste cellule resistenti ai farmaci mostrano una riduzione del numero di colonie con l'aumentare delle dosi di farmaci.
In questa procedura, piastra 2.000 cellule utilizzando 2 millilitri di terreno per pozzetto nelle piastre a 6 pozzetti. Dopo 24 ore, aggiungere concentrazioni crescenti di docetaxel per entrambe le linee cellulari DU145 e 22Rv1. Aggiungere DMSO solo a un pozzetto come controllo allo stesso volume utilizzato per la dose più alta di docetaxel. Dopo 72 ore, aspirare il terreno contenente il farmaco e aggiungere terreno fresco privo di docetaxel.
Incubare le piastre per 1 o 2 settimane fino a quando le colonie sono visibili al microscopio. Per colorare le colonie, lavarle delicatamente con 2 o 3 millilitri di PBS e incubarle con 2 o 3 millilitri di soluzione di cristallovioletto per 20 minuti all'interno della cappa di coltura tissutale o di una cappa aspirante.
Successivamente, rimuovere la soluzione colorante e lavare le piastre con 2 o 3 millilitri di acqua. Quindi, rimuovere l'acqua e asciugare le piastre all'aria. Scatta immagini digitali delle lastre per la rappresentazione della figura. Analizza il risultato visualizzando i pozzetti e contando manualmente le colonie con l'aiuto di un pennarello e rappresenta la percentuale di vitalità cellulare in un grafico.