Induzione dell'autofagia basata su ADI nelle cellule di cancro alla prostata: una tecnica basata su enzimi per misurare la risposta autofagica nelle cellule

L'autofagia è un processo intracellulare che facilita la degradazione di componenti citoplasmatici e organelli indesiderati all'interno di compartimenti digestivi specializzati chiamati lisosomi. Per valutare l'autofagia, iniziare con una coltura aderente di cellule tumorali della prostata che esprimono proteine marcatrici autofagiche chiamate LC3 accoppiate a proteine fluorescenti verdi.

Intrinsecamente, le cellule tumorali della prostata mancano dell'enzima argininosuccinato sintasi necessario per la sintesi degli aminoacidi arginina. Queste cellule sono, quindi, dipendenti dall'integrazione esterna di arginina attraverso i terreni per la sopravvivenza e la proliferazione.

Successivamente, trattare le cellule con arginina deiminasi o ADI. L'ADI idrolizza l'arginina libera nel terreno, portando alla deplezione dell'arginina. Di conseguenza, le cellule subiscono uno stress metabolico, avviando internamente una risposta autofagica. Contemporaneamente, trattare le cellule con un colorante fluorescente rosso che etichetta i lisosomi all'interno delle cellule.

Durante l'autofagia, strutture membranose a forma di coppa chiamate fagofori si assemblano attorno ai componenti citoplasmatici danneggiati. Alla fine, si espandono e sigillano il loro carico mentre si coniugano con le proteine marcatrici autofagiche LC3 per formare vescicole a doppia membrana o autofagosomi. Le proteine LC3 forniscono anche tag fluorescenti agli autofagosomi. Le vescicole si fondono quindi con i lisosomi per formare autolisosomi. Le proteasi lisosomiali all'interno degli autolisosomi degradano i componenti cellulari inghiottiti.

In tempo reale, osserva la fluorescenza luminosa degli autofagosomi e dei lisosomi per determinare la loro distribuzione all'interno delle cellule.

Per iniziare, coltivare cellule tumorali della prostata umana che esprimono la Light Chain 3 accoppiata a proteine fluorescenti verdi su piastre di coltura con fondo di vetro rivestite di poli-D-lisina da 35 millimetri, come descritto nel protocollo di testo.

Le cellule devono essere piastrate a una densità sufficiente per facilitare una rapida proliferazione, ma non così tanto da far crescere eccessivamente le cellule e raggrupparle al momento dell'imaging. Trattare campioni cellulari selezionati con arginina deaminasi, o ADI, in PBS per esaurire le cellule di arginina libera e indurre stress metabolico nelle cellule tumorali.

Circa un'ora prima dell'imaging, diluire 1,5 microlitri di LysoTracker Red con 20 millilitri di RPMI contenenti il 10% di FBS e l'1% di antibiotici. Preparare le soluzioni con ADI per i campioni selezionati che sono stati trattati.

Dopo aver riscaldato tutti i terreni a 37 gradi Celsius, aggiungere i terreni appropriati a ciascun piatto di coltura. Incubare le cellule con RPMI contenente LysoTracker Red per 15-45 minuti a 37 gradi Celsius.

Circa 30 minuti prima dell'imaging, accendere l'involucro ambientale della stazione meteorologica e consentire l'equilibrio a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Lavare le celle con PBS e sostituire i terreni con RPMI standard contenenti solo il 10% di FBS e l'1% di antibiotici.

Aggiungere ADI ai campioni come indicato. Monta piastre di coltura con fondo in vetro da 35 millimetri in un adattatore personalizzato. Utilizzare olio da immersione sull'obiettivo con ingrandimento 60X, apertura numerica 1,42 e posizionare il piatto di coltura montato sul tavolino del microscopio.

• Autophagy - An intracellular process that degrades unwanted cytoplasmic components.
• Argininosuccinate Synthase - An enzyme absent in prostate cancer cells essential for arginine synthesis.
• Arginine Deiminase (ADI) - Enzyme that hydrolyzes free arginine in media, causing cell stress.
• LC3 Proteins - Autophagic marker proteins that provide fluorescent tags to autophagosomes.
• Lysotracker Red DND-99 - A dye used to label lysosomes within cells during autophagy.

• Introduce Autophagy - A degradative process eliminating unwanted parts in cells (e.g., autophagy video).
• Outline Prostate Cancer Cells - Lacking an enzyme, they depend on external arginine sources (e.g., prostate enzyme).
• Explain Induction of Autophagy - ADI depletes arginine causing autophagy in the cells (e.g., autophagy induction).
• Connect to Experiment - The cells are simultaneously treated with lysotracker red DND-99 (e.g., autophagy dye).

• What is autophagy and how does it relate to prostate cancer cells (include ADI)?
• What are LC3 proteins and their role in autophagy?
• How does Arginine Deiminase initiate an autophagic response in cells?

• Practical Applications - Autophagy serves as a potential target for prostate cancer treatment (e.g., autophagy and prostate cancer).
• Industry Impact - Autophagy research benefits healthcare and pharmaceutical sectors (e.g., prostate cancer enzyme marker).
• Societal Importance - Observing real-time autophagy in cells can inform disease treatments (e.g., autophagy videos).
• Link to Scientific Advancements - Dyes like lysotracker red dnd-99 help visualize cellular processes.