Purificazione dei peptidi: una tecnica basata su RP-HPLC per estrarre peptidi da lisati proteici digeriti

Per isolare e purificare i peptidi, iniziare con una sospensione di lisato proteico contenente una miscela di peptidi digeriti.

Trattare la miscela con acido trifluoroacetico o reagente a base di TFA. Questo reagente anionico o caricato negativamente forma un complesso di coppie ioniche con residui basici o caricati positivamente sui peptidi, mascherando così la loro carica e migliorando l'idrofobicità dei peptidi.

A questo punto, assemblare una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa, o RP-HPLC, contenente una fase stazionaria porosa a base di silice, immobilizzata con leganti idrofobici non polari. Aggiungere un tampone di equilibrio compatibile con i peptidi alla colonna per preparare la fase stazionaria prima dell'applicazione del campione.

A questo punto, caricare il campione acidificato nella colonna. All'interno della colonna, i peptidi idrofobici si adsorbono selettivamente ai ligandi idrofobici della fase stazionaria. Far scorrere un tampone di lavaggio attraverso la colonna per eluire eventuali particelle non legate o indesiderate.

Successivamente, far passare un tampone di eluizione organica meno polare, con elevata idrofobicità, attraverso