Purificazione dei peptidi: una tecnica basata su RP-HPLC per estrarre peptidi da lisati proteici digeriti

Per isolare e purificare i peptidi, iniziare con una sospensione di lisato proteico contenente una miscela di peptidi digeriti.

Trattare la miscela con acido trifluoroacetico o reagente a base di TFA. Questo reagente anionico o caricato negativamente forma un complesso di coppie ioniche con residui basici o caricati positivamente sui peptidi, mascherando così la loro carica e migliorando l'idrofobicità dei peptidi.

A questo punto, assemblare una colonna per cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa, o RP-HPLC, contenente una fase stazionaria porosa a base di silice, immobilizzata con leganti idrofobici non polari. Aggiungere un tampone di equilibrio compatibile con i peptidi alla colonna per preparare la fase stazionaria prima dell'applicazione del campione.

A questo punto, caricare il campione acidificato nella colonna. All'interno della colonna, i peptidi idrofobici si adsorbono selettivamente ai ligandi idrofobici della fase stazionaria. Far scorrere un tampone di lavaggio attraverso la colonna per eluire eventuali particelle non legate o indesiderate.

Successivamente, far passare un tampone di eluizione organica meno polare, con elevata idrofobicità, attraverso la colonna. A causa della loro affinità selettiva verso il tampone di eluizione, i peptidi legati vengono desorbiti dalla matrice della colonna.

Raccogliere l'eluato contenente peptidi dalla colonna. Liofilizzare l'eluato per rimuovere il contenuto d'acqua e ottenere una polvere secca di peptidi puri e stabili.

Per acidificare il campione, aggiungere circa 20 microlitri di acido trifluoroacetico al 5%, o TFA, per millilitro di lisato. Mescolare bene la provetta e utilizzare una striscia di pH per misurare il pH. Se necessario, aggiungere un ulteriore 5% di TFA per regolare il pH a 2,5. Quindi, collegare l'estremità più corta di una colonna C18 a un collettore a vuoto. Dopo aver impostato il vuoto tra 17 e 34 kPa, utilizzare 3 millilitri di acetonitrile al 100% e una pipetta di vetro per bagnare la colonna.

Equilibrare la colonna utilizzando una pipetta di vetro e applicando due aliquote da 3 millilitri di TFA allo 0,1%. Quindi, caricare il campione acidificato sulla colonna. Utilizzare tre volumi da 3 millilitri di TFA allo 0,1% per lavare la colonna. Quindi, applicare 2 millilitri di ACN al 40%, TFA allo 0,1% per eluire il campione e raccogliere due frazioni da 2 millilitri in provette di vetro. Con il parafilm, coprire i tubi di eluato e utilizzare un ago calibro 20 per praticare da tre a cinque fori nel coperchio prima di liofilizzare i campioni durante la notte.