Conversione del bisolfito del DNA genomico: un metodo per studiare la metilazione del DNA in campioni di DNA genomico da tessuto tumorale gastrointestinale

La metilazione del DNA comporta l'aggiunta di gruppi metilici ai residui di citosina del DNA per formare metil-citosina, causando l'alterazione del DNA e la regolazione dell'espressione genica.

Per studiare la metilazione del DNA, inizia prelevando un estratto di DNA grezzo da cellule cancerose. Aggiungere un tampone di diluizione e incubare a temperatura ambiente. Il tampone diluisce la miscela e denatura il DNA a doppio filamento in DNA a singolo filamento, favorendo l'accessibilità delle basi per le reazioni successive.

Aggiungere un reagente di conversione e incubare al buio. Il bisolfito di sodio nel reagente innesca la solfonazione e la successiva deaminazione dei residui di citosina non metilati, con conseguente formazione di uracil-solfonato. Tuttavia, i residui di citosina metilata rimangono invariati.

Successivamente, integrare il DNA con un tampone legante e trasferirlo in una colonna filtrante di spin preassemblata. Il tampone aiuta il DNA a legarsi al filtro.

Centrifuga per rimuovere la miscela di tampone e reagente bisolfito dal DNA intrappolato nella colonna. Scartare il flusso. Aggiungere un tampone di desolfonazione alcalina al DNA. Il tampone aiuta nella rimozione del gruppo solfito dall'uracil-solfonato per formare uracile.

Centrifugare per rimuovere il tampone esaurito. Ora, aggiungere un tampone di eluizione alla colonna per eluire il DNA convertito. Eseguire la PCR per amplificare il DNA. Tutti i residui di uracile convertiti si amplificano come timine, mentre i residui di citosina metilata si amplificano come citosine.

Sequenziare i residui di citosina del DNA amplificato per generare un profilo di metilazione del campione.

Eseguire il trattamento con bisolfito su 45 microlitri di tessuto digerito utilizzando un kit di conversione del bisolfito secondo le istruzioni del produttore. Aggiungere 5 microlitri di tampone di diluizione al campione e incubarlo a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Nel frattempo, preparare il reagente di conversione del bisolfito aggiungendo 750 microlitri di acqua distillata e 210 microlitri di tampone di diluizione a una provetta di reagente di conversione CT. Mescolare i tubi agitando per 10 minuti. Quindi, aggiungere 100 microlitri del reagente di conversione CT preparato a ciascun campione e mescolare per inversione.

Incubare i campioni al buio a 50 gradi Celsius per 12-16 ore. Dopo l'incubazione, posizionare i campioni sul ghiaccio per 10 minuti. Aggiungere 400 microlitri di tampone legante e miscelare ogni campione pipettando su e giù. Caricare ogni campione in una colonna rotante e posizionare la colonna in una provetta di raccolta da 2 millilitri. Centrifugare i campioni alla massima velocità per 1 minuto ed eliminare il flusso. Aggiungere 200 microlitri di tampone di lavaggio a ciascuna colonna e centrifugare alla massima velocità per 1 minuto, quindi scartare il flusso.

Aggiungere 200 microlitri di tampone di desolfonazione a ciascuna colonna e lasciare riposare le colonne a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare le colonne alla massima velocità per 1 minuto e scartare il flusso attraverso. Lavare la colonna due volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio, centrifugando per 1 minuto alla massima velocità dopo ogni lavaggio.

Aggiungere 46 microlitri di acqua distillata a ciascuna colonna e metterla in una nuova provetta sterile in polipropilene monouso da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette per 2 minuti per eluire il DNA e scartare la colonna. Il DNA è ora pronto per l'analisi. Utilizzare il DNA modificato con bisolfito come modello per la PCR quantitativa specifica per la metilazione per valutare la metilazione della regione del promotore in ciascuna analisi genica. Combinare i reagenti come descritto nel manoscritto del testo e utilizzare uno strumento PCR in tempo reale a 96 pozzetti per eseguire il protocollo dei cicli termici.