Isolamento peritoneale dei neutrofili a bassa densità: una tecnica per ottenere neutrofili a bassa densità dal liquido di lavaggio peritoneale utilizzando la selezione cellulare attivata magneticamente

I neutrofili a bassa densità, o LDN, sono una sottopopolazione distinta di neutrofili che si trova in numero elevato durante condizioni patologiche come il cancro gastrointestinale. Gli LDN possono essere isolati dai lavaggi della cavità peritoneale o dal liquido di lavaggio dei pazienti.

Innanzitutto, filtrare il liquido di lavaggio per rimuovere i detriti di tessuto. Centrifugare il filtrato per ottenere un pellet contenente cellule del sangue, comprese le LDN. Risospenderlo in un tampone adatto. Sovrapporre questa sospensione su un mezzo di gradiente di densità adatto e ottimale per l'isolamento LDN.

Centrifuga per separare i diversi componenti del sangue in base alla loro densità relativa. I globuli rossi più densi formano lo strato inferiore, mentre la frazione plasmatica meno densa forma lo strato più alto. Le LDN meno dense occupano lo strato intermedio insieme ad altre celle mononucleate.

Trasferire lo strato intermedio in una provetta nuova contenente un reagente bloccante. I componenti del reagente bloccano i siti di legame non specifici su tutte le superfici delle cellule non bersaglio e aumentano la specificità per LDN durante la successiva marcatura.

Aggiungere microsfere coniugate con anticorpi che hanno come bersaglio una specifica molecola di superficie cellulare sovraespressa sulle LDN. Incubare per far sì che i complessi anticorpo-perlina si leghino alle loro molecole bersaglio sulle LDN.

Far passare la sospensione incubata attraverso una colonna posta in un campo magnetico. Sotto l'influenza magnetica, tutti i complessi LDN-microsfere aderiscono alla parete della colonna mentre le cellule non marcate vi passano attraverso.

Rimuovere la colonna. Lavare il contenuto utilizzando un tampone adatto per eluire e raccogliere la frazione contenente LDN.

Per acquisire i neutrofili, innanzitutto, infondere 1 litro di soluzione fisiologica sterile normale immediatamente prima della chiusura della ferita direttamente nella cavità addominale di un paziente che ha appena subito un intervento chirurgico addominale a causa di neoplasie gastrointestinali e lavare ampiamente la cavità addominale per almeno 1 minuto. Quindi, mescolare la soluzione salina all'interno della cavità e recuperare 200 millilitri di liquido di lavaggio con quattro siringhe da 50 millilitri.

In laboratorio, trasferire il liquido di lavaggio peritoneale attraverso un filtro di nylon da 100 micrometri in singole provette da 50 millilitri per la centrifugazione. Risospendere i pellet in 5 millilitri di PBS integrati con EDTA allo 0,02% e sovrapporre accuratamente ciascuna sospensione cellulare su 3 millilitri di soluzione a gradiente di densità. Dopo la separazione in gradiente di densità, prelevare da 2 a 3 millilitri dello strato intermedio da ciascuna provetta e lavare i campioni di fluido peritoneale in 10 millilitri di PBS fresco più EDTA per provetta. Versare i pellet in 10 millilitri di PBS fresco più EDTA per un ulteriore lavaggio e diluire le cellule a una concentrazione di tampone da 1 x 10 a una settima cella per 60 micrometri di selezione cellulare attivata magneticamente, o MACS.

Bloccare qualsiasi legame non specifico con 20 microlitri di blocco Fc per 10 minuti a 4 gradi Celsius, seguito dall'aggiunta di 20 microlitri di perline magnetiche anti-CD66b. Dopo 10 minuti a 4 gradi Celsius, lavare e risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone MACS e aggiungere le cellule a una colonna magnetica di dimensioni adeguate all'interno del campo magnetico di un separatore magnetico adatto. Quando tutte le cellule CD66b negative hanno attraversato la colonna, aggiungere 15 millilitri di tampone MACS fresco al serbatoio della colonna e trasferire la colonna dal separatore magnetico in un nuovo tubo conico. Quindi, immergere immediatamente la colonna per far scorrere il positivo CD66b marcato magneticamente nel tubo.

• Low-density neutrophils (LDNs) - A distinct neutrophil subpopulation increased in pathological conditions.
• Ficoll-Paque Plus protocol - Method for isolating neutrophils using density gradient separation.
• Peritoneal lavage procedure - Technique for washing and collecting fluid from the peritoneal cavity.
• Magnetic cell sorting (Miltenyi Biotec) - Technique to selectively isolate specific cells using magnetic microbeads.
• CD66b - A surface molecule overexpressed on LDNs, useful for their identification and isolation.

• Intrduce LDNs – Subtype of neutrophil prevalent in diseases like cancer (e.g., low density neutrophils).
• Outline Ficoll-Paque Plus protocol – Method for cell separation based on density (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Explain Peritoneal lavage procedure – Technique to collect cells from the peritoneal cavity (e.g., peritoneal lavage procedure).
• Connect to Magnetic cell Sorting – Isolation of LDNs using magnetic microbeads and specific markers (e.g., CD66b).

• What are low-density neutrophils and how to identify them using peritoneal lavage procedure?
• How does Ficoll-Paque Plus protocol help in separating LDNs?
• How does magnetic cell sorting with CD66b microbeads isolate LDNs?

• Practical Applications – Isolation of LDNs for clinical and research purposes (e.g., Ficoll-Paque Plus protocol).
• Industry Impact – Advances in cell isolation techniques benefitting biomedical sector (e.g., magnetic cell sorting).
• Societal Importance – Improved understanding and treatment of certain diseases (e.g., cancer).
• Link to Scientific Advancements – Automatic isolation of specific cells aiding in research studies.