Microscopia a fluorescenza time-lapse di trappole extracellulari neutrofile o NET: una tecnica per analizzare l'interazione post-adesione tra cellule tumorali e NET

Durante condizioni patologiche come il cancro, i neutrofili attivati rilasciano trappole extracellulari per neutrofili o NET, una rete di fibre di DNA extracellulari associate a istoni ed enzimi proteolitici. Queste strutture intrappolano le cellule tumorali e svolgono un ruolo chiave nelle metastasi del cancro.

Studiare il comportamento post-adesione delle cellule tumorali intrappolate nei NET in vitro, in primo luogo, coltivare neutrofili a bassa densità - una sottopopolazione di neutrofili - in un piatto di coltura rivestito di polimero che facilita l'adesione cellulare. Incubare per attivare i neutrofili per rilasciare NET simili a mesh.

Successivamente, aggiungi un colorante nucleare fluorescente verde impermeabile alla membrana per colorare le fibre di DNA nei NET in modo specifico. Rimuovere il mezzo esaurito. Aggiungere una sospensione di cellule tumorali alla coltura di neutrofili.

Incubare la coltura per un breve periodo per facilitare l'interazione cellula tumorale-NET. La componente DNA dei NET funziona come un fattore chemiotattico che stimola la migrazione delle cellule tumorali e ne favorisce l'adesione ai NET.

Rimuovere il mezzo esaurito. Sciacquare delicatamente la coltura con un terreno fresco appropriato per rimuovere eventuali cellule tumorali non legate dal piatto di coltura. Reintegrare con un nuovo terreno contenente siero.

Visualizzare la coltura per una durata prolungata utilizzando la microscopia video time-lapse per analizzare gli eventi interattivi tra NET e cellule tumorali. Nel tempo, i NET forniscono un microambiente adatto che facilita la proliferazione delle cellule tumorali. Utilizzare un software adatto per osservare la proliferazione delle cellule tumorali su NET fluorescenti verdi.

Coltivare e colorare i neutrofili peritoneali a bassa densità in una piastra da 35 millimetri, rivestita di poli-L-lisina come dimostrato, seguita da un breve lavaggio in 2 millilitri di BSA allo 0,1% più RPMI 1640.

Sostituire il terreno con 1 x 10 alla sesta cellula tumorale gastrica non colorata sospesa in 2 millilitri di RPMI integrata con BSA per un'incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, sciacquare le cellule in 2 millilitri di RPMI fresco integrato con BSA per 5 minuti a temperatura ambiente, seguito da un leggero roteamento per rimuovere eventuali cellule tumorali non attaccate.

Quindi, sostituire il surnatante con DMEM integrato con FBS e antibiotici e montare la capsula in un sistema di osservazione cellulare a vista intera per l'analisi in time-lapse dell'intrappolamento delle cellule tumorali da parte dei NET.