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0 visualizzazioni • 3:43 min. • April 30th, 2023
Gli esosomi sono le strutture vescicolari extracellulari che vengono secrete dalle cellule in coltura nel surnatante. Per preparare un blocco di esosomi, iniziare prendendo un surnatante di coltura contenente esosomi in una provetta. Centrifugare la provetta ad alta velocità per pellettizzare gli esosomi intatti. Eliminare il surnatante rimanente.
Trattare il pellet di esosoma con glutaraldeide presente nel tampone di fissaggio. Incubare la miscela su ghiaccio per il tempo desiderato per preservare la morfologia degli esosomi. La glutaraldeide si infiltra negli esosomi e lega le proteine. Il tampone di fissaggio mantiene gli esosomi a pH neutro per il processo di fissazione a valle.
Scartare il tampone contenente glutaraldeide e aggiungere una soluzione di tetrossido di osmio, un fissativo secondario che permeabilizza il doppio strato di membrana e fissa i lipidi presenti negli esosomi. Rimuovere la soluzione di tetrossido di osmio e trattare gli esosomi con una serie di concentrazioni crescenti di acetone. Questo processo disidrata gli esosomi.
Sostituire l'acetone assoluto con la miscela di acetone medio incorporante. A poco a poco, aumentare il rapporto del mezzo di inclusione in questa miscela.
Versare la miscela di inclusione contenente esosomi negli stampi desiderati. Asciugare gli stampi in forno ad alta temperatura. Ciò porterà alla polimerizzazione del mezzo di inclusione attorno agli esosomi, dando origine a blocchi.
Per fissare il pellet di esosoma purificato, aggiungere 1 millilitro di glutaraldeide al 2,5% in una soluzione di cacodilato di sodio 0,1 M a pH 7,0. Incubare le vescicole a doppio strato lipidico per 1 ora a 4 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere il fissativo e sciacquare i pellet con 1 millilitro di una soluzione tampone di cacodilato di sodio 0,1 M a temperatura ambiente per 10 minuti.
Quindi, post-fissare i campioni con 1 millilitro di tetrossido di osmio al 2% per 1 ora a 4 gradi Celsius. Rimuovere il fissativo e sciacquare il pellet dell'esosoma tre volte con il tampone cacodilato di sodio 0,1 M, cambiando il tampone ogni 10 minuti. Quindi, disidratare il campione agitandolo per 10 minuti ciascuno in una serie di concentrazioni di acetone graduate.
Quindi, mescola una soluzione di tre parti di acetone e una parte di miscela di incorporamento a bassa viscosità. Sostituire l'acetone con questa miscela e incubare il campione per 30 minuti. Continuare ad aumentare il rapporto del terreno di inclusione a bassa viscosità, incubando per 30 minuti ad ogni passaggio.
Infine, incubare il pellet di esosoma nel 100% della miscela di inclusione a bassa viscosità per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, incorporare il campione in una miscela di inclusione pura a bassa viscosità utilizzando uno stampo da inclusione e cuocerlo per 24 ore a 65 gradi Celsius.