Preparazione del blocco di esosomi: un protocollo per preservare gli esosomi da cellule di cancro del colon umano in coltura

Gli esosomi sono le strutture vescicolari extracellulari che vengono secrete dalle cellule in coltura nel surnatante. Per preparare un blocco di esosomi, iniziare prendendo un surnatante di coltura contenente esosomi in una provetta. Centrifugare la provetta ad alta velocità per pellettizzare gli esosomi intatti. Eliminare il surnatante rimanente.

Trattare il pellet di esosoma con glutaraldeide presente nel tampone di fissaggio. Incubare la miscela su ghiaccio per il tempo desiderato per preservare la morfologia degli esosomi. La glutaraldeide si infiltra negli esosomi e lega le proteine. Il tampone di fissaggio mantiene gli esosomi a pH neutro per il processo di fissazione a valle.

Scartare il tampone contenente glutaraldeide e aggiungere una soluzione di tetrossido di osmio, un fissativo secondario che permeabilizza il doppio strato di membrana e fissa i lipidi presenti negli esosomi. Rimuovere la soluzione di tetrossido di osmio e trattare gli esosomi con una serie di concentrazioni crescenti di acetone. Questo processo disidrata gli esosomi.

Sostituire l'acetone assoluto con la miscela di acetone medio incorporante. A poco a poco, aumentare il rapporto del mezzo di inclusione i