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0 visualizzazioni • 3:10 min. • April 30th, 2023
Per eseguire la colorazione negativa degli esosomi - vescicole sferiche nanometriche - iniziare prendendo una griglia di microscopia elettronica adatta. Prepara la griglia usando uno scaricatore di incandescenza. Questo processo rende la superficie della griglia idrofila per una migliore adesione dei campioni.
Contemporaneamente, assumere una sospensione di esosomi purificati in una provetta. Integrare la provetta con paraformaldeide, un fissativo per campioni, e incubare. La paraformaldeide penetra negli esosomi e lega le proteine e gli acidi nucleici. Questo passaggio è fondamentale per preservare la morfologia degli esosomi.
A questo punto, caricare la sospensione dell'esosoma sulla griglia pre-preparata e incubare per consentire l'adsorbimento. Quindi, aggiungi alcune gocce di acetato di uranile, una macchia di metallo pesante, sulla griglia. Gli ioni uranile si legano alle proteine e ai lipidi della membrana, formando un deposito attorno al confine dell'esosoma.
Infine, lavare la griglia in acqua per rimuovere la macchia in eccesso. Lasciare asciugare la griglia e creare immagini utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione o TEM.
Quando un fascio di elettroni colpisce gli esosomi, la macchia che circonda il campione disperde più elettroni. Gli esosomi, essendo meno densi di elettroni, consentono il passaggio del fascio. Questi elettroni differenziati vengono catturati dal sistema di imaging per formare un'immagine ad alto contrasto.
Gli esosomi colorati negativamente appaiono più chiari, con un bordo scuro intorno a loro.
Per eseguire la colorazione negativa, fissare gli esosomi purificati dopo l'isolamento con 1 millilitro di paraformaldeide al 2% per 5 minuti. Trattare le griglie EM in rame da 200 mesh rivestite con film di carbonio sottile per 1 minuto. Quindi, caricare da 5 a 7 microlitri della soluzione di sospensione dell'esosoma su una griglia e incubarla per 1 minuto. Se la concentrazione di esosoma è troppo alta, diluire la concentrazione a un livello appropriato.
Immediatamente, colorare gli esosomi con circa 20 gocce di una soluzione filtrata di acetato di uranile all'1% sulla superficie della griglia EM. Rimuovere la soluzione di acetato di uranile in eccesso dalla griglia a contatto con il bordo della griglia con carta da filtro. Quindi, sciacquare rapidamente la griglia con una goccia d'acqua.
Usa un paio di pinzette per posizionare la griglia sul tavolo e copri parzialmente la griglia con un piatto di coltura. Lasciare asciugare la griglia per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi creare un'immagine della griglia o conservarla in una scatola a griglia per microscopio elettronico per osservazioni future.