Isolamento di cellule mononucleate Lamina Propria: una tecnica di centrifugazione in gradiente di densità a base di silice per ottenere cellule mononucleate dal colon murino

La lamina propria intestinale, situata al di sotto dell'epitelio intestinale, è costituita da tessuto connettivo lasso insieme a una fitta rete di fibre di collagene contenente una vasta gamma di cellule come fibroblasti, cellule mononucleate, inclusi linfociti e monociti. Queste cellule svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi.

Per isolare le cellule mononucleate, inizia prelevando frammenti di colon di topo. Trattare i frammenti con un tampone digestivo contenente enzimi collagenasi. Gli enzimi collagenasi digeriscono le fibre di collagene all'interno del tessuto, rilasciando le cellule in sospensione.

Raccogliere il surnatante e filtrarlo attraverso filtri cellulari per rimuovere il tessuto non digerito e i detriti e ottenere una sospensione unicellulare. Aggiungere un tampone refrigerato al filtrato per inattivare gli enzimi collagenasi.

Centrifugare per separare le celle. Scartare il surnatante contenente gli enzimi e risospendere il pellet cellulare in un mezzo di separazione a base di silice a bassa densità. Successivamente, sovrapporre la sospensione su un mezzo di separazione a base di silice ad alta densità per creare un gradiente di separazione.

Centrifugare il composto. Le celle mononucleate sedimentano e formano uno strato bianco all'interfaccia tra gli strati del gradiente di densità. Trasferire con cautela lo strato di interfaccia bianco in una provetta nuova contenente un tampone adatto.

Centrifuga per ottenere un pellet contenente celle mononucleate purificate. Risospendere il pellet nel tampone per ulteriori analisi a valle.

Per iniziare, aggiungere 20 millilitri di tampone digestivo collagenasi al tubo contenente i frammenti del colon lavati. Sigillare la provetta e posizionarla in uno shaker orbitale a 37 gradi Celsius con una velocità di rotazione di 2 x g per 60 minuti. Assicurarsi che i frammenti di tessuto siano in costante movimento durante l'agitazione.

Versare 5 millilitri di mezzo di separazione della densità a base di silice al 66% in ciascuna delle tre provette separate in polipropilene da 15 millilitri. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica da 25 millilitri per raccogliere solo il surnatante dalla digestione della collagenasi 1. Filtrare il surnatante attraverso un filtro cellulare in tessuto filtrante da 40 microlitri posizionato in un tubo conico pulito in polipropilene da 50 millilitri. Riempire completamente la provetta con tampone per colon raffreddato per estinguere il tampone per la digestione della collagenasi. Quindi, centrifugare le cellule, aspirare il surnatante e mantenere il pellet sul ghiaccio.

Continuare a eseguire la Digestione Collagenasi 2 come indicato nel protocollo di testo. Dopo aver completato la digestione della collagenasi 2, sciacquare energicamente i frammenti di tessuto avanti e indietro tra il tubo e una siringa da 10 millilitri attraverso un ago smussato da 18 G. Ripetere questo risciacquo per almeno sette-otto passaggi, continuando fino a quando non sono visibili frammenti di tessuto grossolani o detriti.

Successivamente, passare la sospensione di disaggregazione tissutale attraverso un filtro cellulare in tessuto filtrante a pori da 40 micrometri inserito in un tubo di polipropilene pulito da 50 millilitri. Riempire la provetta fino al bordo con tampone per colon raffreddato per estinguere la digestione e centrifugare a 800 x g e a 4 gradi Celsius per 5 minuti.

Scartare il surnatante tramite aspirazione a vuoto e tirare il pellet risospeso dalla digestione della collagenasi 1 al tubo corrispondente. Successivamente, risospendere ogni pellet in 24 millilitri di mezzo di separazione della densità al 44% a base di silice per colon. Utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sovrapporre lentamente 8 millilitri di questo terreno su ciascuna delle tre provette contenenti il 66% di terreno di separazione della densità a base di silice.

Bilanciare attentamente le provette all'interno dei secchi da centrifuga utilizzando una bilancia o una bilancia. Centrifugare a 859 x g e a 20 gradi Celsius per 20 minuti senza interruzioni. Lasciare riposare completamente i rotori prima di rimuovere le provette, facendo attenzione a non rompere le celle all'interfaccia del gradiente.

Visualizza l'interfaccia del gradiente vicino al segno di 5 millilitri dove in genere è presente una banda bianca spessa 1-2 millimetri. Aspirare a vuoto ed eliminare i 7 millilitri superiori del gradiente per consentire un più facile accesso della pipetta all'interfaccia. Utilizzando l'aspirazione manuale continua e il movimento rotatorio costante del polso, raccogliere lo strato di interfaccia delle cellule. Raccogliere fino a quando l'interfaccia tra i due gradienti è chiara e rifrangente e trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri.