Isolamento delle ghiandole fundiche gastriche: un metodo per isolare le ghiandole fondiche dal tessuto dello stomaco umano

Nell'uomo, il fondo è la parte più alta dello stomaco. L'epitelio fundico è costituito da numerose ghiandole gastriche che secernono succo gastrico, che aiuta la digestione.

Per isolare le ghiandole del fondo gastrico, inizia prendendo il tessuto del fondo umano in un becher. Aggiungere un tampone adatto al becher e lavare energicamente il tessuto del fondo. Il lavaggio rimuove i detriti contaminanti e il sangue dal tessuto fondico.

Trasferire il fazzoletto pulito in una piastra di Petri. Utilizzando una garza sterile, rimuovere lo strato mucoso protettivo, esponendo così lo strato epiteliale sottostante. Usando una pinza, raschiare con forza lo strato epiteliale superiore dal tessuto.

Trasferire l'epitelio raschiato, su un'altra piastra di Petri, e tritarlo in pezzi più piccoli. Aggiungere i pezzi tritati in un pallone contenente un tampone integrato con enzimi collagenasi. Incubare alla temperatura desiderata con agitazione costante per evitare la formazione di grumi.

collagenasi digerisce le proteine della matrice extracellulare presenti nello strato epiteliale, liberando in sospensione le ghiandole fundiche dissociate. Filtrare la sospensione in un tubo nuovo per rimuovere eventuali grumi non dissociati.

Mantenere il filtrato ghiandolare indisturbato sul ghiaccio per sedimentare le ghiandole. Scartare il surnatante contenente detriti cellulari e risospendere il sedimento ghiandolare in un tampone fresco. Centrifugare e conservare il pellet ghiandolare fino a nuovo utilizzo.

Per iniziare, raccogli il tessuto preparato in un grande contenitore di plastica riempito con DPBS privo di calcio/magnesio. Lasciare il contenitore di plastica sul ghiaccio fino al momento dell'uso. Successivamente, con l'aiuto di una pinza, lavare energicamente il tessuto in un becher sterile, contenente 100 millilitri di DPBS privo di calcio/magnesio, per circa 30 secondi. Quindi, usa una garza sterile per rimuovere lo strato di muco dall'epitelio.

Quindi, usa una pinza grande per tenere saldamente lo strato muscolare del tessuto. Quindi, usa una grande pinza emostatica curva e raschia l'epitelio con forza. Conservare l'epitelio raschiato in una capsula di Petri sterile in polistirolo. Per ottimizzare la digestione dei tessuti, tritare il tessuto epiteliale in frammenti. Quindi, lavare il tessuto con DPBS privo di calcio/magnesio integrato con antibiotici.

Lavare più volte per rimuovere il sangue. Gettare il bucato in un bicchiere di scarico. Quindi, raccogliere i frammenti epiteliali lavati in un pallone di vetro a fondo rotondo da 125 millilitri con una barra di agitazione da 25 millilitri e un terreno di incubazione preriscaldato. Dopo aver raccolto i frammenti di tessuto, sigillare il pallone a fondo tondo con un setto di gomma. Quindi, inserire un ago spinale da 20 G nei setti. Collegare i setti a una bombola di ossigeno con tubo di gomma.

Inserire da 10 a 15 aghi di deflusso nei setti per evitarne la rottura, quindi utilizzare i morsetti per fissare la configurazione a un supporto ad anello. Quindi, attivare il deflusso di ossigeno al minimo. Successivamente, calibrare il bagnomaria a 37 gradi Celsius su una piastra di agitazione per 30-45 minuti. Una volta calibrato, posizionare l'impianto nel bagnomaria. Dopo 15 minuti di incubazione, verificare la presenza di ghiandole dissociate.

Dopo il tempo di incubazione desiderato, aggiungere 50 millilitri di DMEM/F-12 preriscaldato al terreno di incubazione utilizzando una pipetta sierologica. Successivamente, filtrare la miscela di ghiandole ottenuta attraverso una garza sterile in quattro tubi conici da 50 millilitri. Quindi, incubare il filtrato su ghiaccio per 15 minuti. Ciò consentirà alla ghiandola di depositarsi sul fondo del tubo conico. Utilizzare una pipetta sierologica per scartare 40 millilitri di surnatante dalla parte superiore della sospensione ghiandolare.

Risospendere i restanti 10 millilitri della miscela ghiandolare in 10 millilitri di DPBS integrato con antibiotici. Quindi, distribuire l'intera miscela in provette per colture cellulari da 5 millilitri. Centrifugare le provette a 65 x g per 5 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante.