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0 visualizzazioni • 3:26 min • April 30th, 2023
Per rilevare una specifica sequenza di RNA in una cellula, inizia prendendo una sezione di tessuto su un vetrino. Sovrapporre la sezione di tessuto con un tampone di ibridazione adatto contenente le sonde di RNA bersaglio.
Queste sonde sono molecole di RNA a forma di Z con una porzione di riconoscimento del bersaglio a un'estremità e una sequenza di coda all'altra estremità. Un braccio distanziatore collega queste due estremità.
Ora, incubare il vetrino in un forno di ibridazione a una temperatura ottimale. Le sonde di RNA a forma di Z entrano nella cellula e si ibridano con la corrispondente sequenza di mRNA bersaglio a coppie.
Togliere la diapositiva dal forno. Immergere il vetrino in una soluzione di lavaggio per rimuovere eventuali sonde non legate e il tampone di ibridazione in eccesso.
Successivamente, aggiungere una soluzione di preamplificatore e incubare. La molecola del preamplificatore si attacca alla sequenza di coda di due sonde Z adiacenti. Questa molecola non si lega a una singola sonda Z, garantendo la specificità.
Quindi, aggiungere la miscela di reagenti dell'amplificatore e incubare. Più molecole di amplificatore si ibridano nella singola sequenza di preamplificatore.
Infine, etichettare la sezione di tessuto con le sonde di marcatura desiderate per rilevare la presenza di una specifica sequenza di RNA nella cellula.
Per avviare l'ibridazione, picchiettare e scorrere i vetrini per rimuovere il liquido in eccesso e rimetterli nel rack dei vetrini. Rimuovere la sonda HPV preriscaldata dal forno e aggiungere circa quattro gocce per coprire completamente ogni sezione. Coprite la teglia con un coperchio e inseritela nel forno per 2 ore a 40 gradi centigradi. Dopo aver completato l'incubazione, rimuovere la teglia dal forno e rimuovere la griglia per vetrini.
Un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino in un rack per vetrini immerso in una capsula per colorare riempito con 1x tampone di lavaggio, lavando i vetrini per 2 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetere con 1x tampone di lavaggio fresco. Toccare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso dai vetrini e riposizionarli nel rack per vetrini. Aggiungere circa quattro gocce di temperatura ambiente AMP1 per sezione per coprire interamente ogni sezione. Coprite la teglia con un coperchio e inseritela nel forno per 30 minuti a 40 gradi centigradi.
Dopo aver tolto la teglia dal forno, rimuovere la griglia scorrevole. Lavorando un vetrino alla volta, rimuovere rapidamente il liquido in eccesso e posizionare il vetrino nel rack per vetrini immerso in una vaschetta per la colorazione riempita con 1x tampone di lavaggio, lavando per 2 minuti a temperatura ambiente con agitazione costante e ripetendo con 1x tampone di lavaggio fresco.