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0 visualizzazioni • 2:42 min. • April 30th, 2023
Per rilevare i segnali cromogenici durante l'ibridazione dell'RNA, iniziare prendendo una sezione di tessuto su un vetrino. Questa sezione contiene l'RNA bersaglio, pre-ibridato con sonda RNA marcata con perossidasi di rafano.
Erogare alcune gocce di diaminobenzidina o DAB, un substrato di rilevazione, sulla sezione di tessuto e incubare.
Il DAB entra nella cellula e l'enzima perossidasi di rafano lo ossida per formare un precipitato marrone. Questa reazione conferisce un colore marrone a specifiche sequenze di RNA nella cellula. Le cellule che non contengono RNA bersaglio non avranno attività perossidasica e rimarranno non colorate.
Quindi, controcolorare la sezione di tessuto con ematossilina. L'ematossilina si lega al DNA e conferisce una macchia viola alla sezione del tessuto.
Trattare la sezione di tessuto con acqua ammoniacale, una soluzione azzurrante. Riduce l'intensità della colorazione viola, facendo apparire le cellule blu. Questo passaggio è essenziale per una chiara visualizzazione delle macchie marroni all'interno delle cellule.
Ora, immergere la sezione di tessuto in concentrazioni crescenti di etanolo e successivamente trattarla con xilene, un solvente organico. Questi passaggi disidratano la sezione di tessuto per ottenere immagini migliori.
Infine, sigillare il vetrino con una soluzione di montaggio e un vetrino coprioggetti e visualizzarlo al microscopio ottico. Le cellule presentano punti marroni puntati che indicano la presenza di RNA bersaglio.
Erogare lo stesso numero di gocce di ciascuna soluzione DAB-A e DAB-B in un tubo di dimensioni adeguate per ottenere circa 120 microlitri di substrato DAB per sezione e vortice. Prendere ogni vetrino, uno alla volta, dal rack per vetrini e picchiettare e scorrere per rimuovere il liquido in eccesso e riposizionarlo nel rack per vetrini. Pipettare circa 120 microlitri di miscela DAB su ciascuna sezione di tessuto, assicurandosi che le sezioni siano coperte. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e procedere con la controcolorazione.
Posizionare una goccia di mezzo di montaggio per lamella di vetro, quindi posizionare la lamella sulle guide e lasciarle asciugare all'aria. Dopo alcune ore, procedere con la valutazione utilizzando un microscopio ottico come descritto nel manoscritto.