Fabbricazione di matrice extracellulare da modello murino: una procedura efficace per preparare la matrice extracellulare della lingua decellularizzata dalla lingua murina

La matrice extracellulare o ECM - la componente non cellulare dell'ambiente tissutale - è costituita da una complessa rete di proteine strutturali e regolatorie e polisaccaridi secreti dalle cellule. La MEC fornisce supporto strutturale e biochimico alle cellule e ne regola la crescita.

Per preparare la matrice extracellulare della lingua, inizia prendendo una lingua di topo appena raccolta. Lavalo con etanolo per rimuovere il suo strato lipidico.

Successivamente, sottoponilo a cicli alternati di gelo e disgelo. Il congelamento favorisce la formazione intracellulare di cristalli di ghiaccio, mentre lo scongelamento scioglie i cristalli di ghiaccio, con conseguente rottura della membrana cellulare.

Ora, sospendi la lingua in una soluzione antibiotica per inibire la crescita batterica. Successivamente, trattare l'organo con una soluzione salina ipertonica. In presenza di un'alta concentrazione di soluto, l'acqua fuoriesce dalle cellule, provocandone il restringimento. Questo passaggio aiuta la morte cellulare e il distacco dalla matrice extracellulare.

Incubare la lingua in un tensioattivo non ionico. Il tensioattivo solubilizza completamente le membrane cellulari e nucleari, facilitando il rilascio del contenuto intracellulare nella soluzione.

Infine, sospendere la lingua in una soluzione contenente ioni calcio e magnesio, seguita da un trattamento con nucleasi. Gli ioni calcio e magnesio potenziano l'attività delle nucleasi per degradare gli acidi nucleici liberi nella soluzione.

Conservare il tessuto linguale decellularizzato in un tampone adatto fino a un'ulteriore lavorazione.

Dopo aver isolato le lingue dai topi soppressi secondo il protocollo di testo, immergere il tessuto in etanolo al 75% per 3 minuti. Quindi, trasferire ciascuna lingua in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri con 1 millilitro di PBS sterile da 10 millimolari. Per eseguire la lisi cellulare, congelare le lingue a meno 80 gradi Celsius per 1 ora. Quindi, scongelare il fazzoletto a temperatura ambiente per 45 minuti. Ripetere il congelamento-scongelamento altre due volte.

Successivamente, in una piastra di coltura da 3,5 centimetri o 6 centimetri contenente il 75% di etanolo, utilizzare un ago chirurgico per caricare ciascuna lingua su un pezzo di sutura chirurgica e, con un piccolo pezzo di carta stagnola sterile, avvolgere l'estremità della sutura. In un piatto di coltura da 3,5 centimetri o 6 centimetri, usa 3 millilitri di PBS per sciacquare ogni lingua per 30 secondi. Quindi, in una bottiglia a bocca larga, preparare 90 microgrammi per millilitro di ampicillina in 250 millilitri di acqua ultrapura sterile e aggiungere una barra di agitazione.

Abbassare fino a 5 lingue nel flacone fino a quando non si trovano a circa 2 centimetri dal fondo e stringere il tappo con parte della sutura rimasta all'esterno del flacone. Posizionare il flacone su un agitatore magnetico per 12 ore. Quindi, dopo l'incubazione, preparare 250 millilitri da 90 microgrammi per millilitro di ampicillina in 1 molare sterile di cloruro di sodio. Trasferire le linguette e mescolare la barretta nella bottiglia e avvitare il tappo. Posizionare il flacone sull'agitatore magnetico per 24 ore.

Per effettuare la lisi cellulare, preparare 90 microgrammi per millilitro di ampicillina in 250 millilitri di Triton X-100 sterile al 2% in PBS. Trasferire le linguette e l'ancoretto nella bottiglia e serrare il tappo. Quindi, mescola la bottiglia per 48 ore. Dopo aver preparato il cloruro di calcio e il cloruro di magnesio con l'ampicillina, spostare il fazzoletto e mescolare la barra nella bottiglia e mescolare la bottiglia per 24 ore.

Preparare 1 millilitro di DNasi 300 micromolari in HBSS in una provetta da microcentrifuga per ogni campione di lingua. Trasferire le lingue nei tubi con la stessa porzione di sutura appesa all'esterno. Quindi, incubare il tessuto a 37 gradi Celsius per 24 ore. Trasferire nuovamente i campioni in un flacone a bocca larga di PBS sterile con ampicillina e posizionarlo sull'agitatore per 24 ore. Dopo l'incubazione, conservare la matrice extracellulare della lingua preparata, o TEM, in PBS sterile a 4 gradi Celsius fino all'uso.