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I microcarrier sono matrici di supporto sferiche di dimensioni micron con pori interconnessi che forniscono un'ampia superficie per l'adesione e la crescita cellulare.
Per fabbricare la matrice extracellulare o i microcarrier derivati dalla ECM, iniziare con una sospensione uniforme di ECM finemente polverizzata. Caricare la sospensione in una siringa collegata a un set per infusione. Fissare la siringa su una pompa a siringa. Posizionare l'ago verticalmente su un pallone criogenico a una distanza adeguata.
Ora, collegare l'ago al terminale positivo di una fonte di alimentazione ad alta tensione. Fissare una striscia di foglio di alluminio piegata sul bordo del pallone e collegarla al terminale di messa a terra per completare il circuito.
Quindi, riempire l'azoto liquido nel pallone con l'estremità interna della striscia di alluminio sommersa. Applicare la tensione desiderata e impostare la pompa a siringa su una portata adeguata per avviare l'elettrospruzzatura. Quando la sospensione conduttiva dell'ECM emerge dalla punta dell'ago, la sua forma si deforma sotto l'influenza del campo elettrico e della tensione superficiale, formando un cono liquido appuntito.
Con incrementi di tensione, la sospensione fuoriesce. Questo alla fine si rompe in goccioline più piccole cariche e cade nel bagno di azoto liquido. L'azoto liquido congela istantaneamente le microgoccioline, cristallizzando le particelle di solvente all'interno.
Trasferire le microgoccioline congelate in un tubo nuovo. Liofilizzare il campione. Questo passaggio aiuta a rimuovere le particelle di solvente congelate dal campione, generando pori al loro posto. Conservare la polvere secca dei microcarrier porosi per ulteriori applicazioni.
Incubare la sospensione ECM criofresata con agitazione continua a 100 giri/min durante la notte. Caricare 3 millilitri di sospensione ECM in una siringa Luer-Lock da 3 millilitri e collegare un set per infusione alato sul foro della siringa. Fissare la siringa all'interno della pompa-siringa. Quindi, fissare l'ago a un supporto per storta e posizionare la punta dell'ago verticalmente a una distanza compresa tra 4 e 6 centimetri dalla parte superiore di un pallone Dewar di forma bassa.
Quindi, collegare un elettrodo a coccodrillo alla punta dell'ago, assicurandosi anche che la clip a coccodrillo sia collegata al terminale positivo dell'alimentatore ad alta tensione. Piegare la striscia di foglio di alluminio sul bordo del pallone aspirante. Quindi, collegare un secondo elettrodo a coccodrillo al bordo esterno della lamina. Collegarlo al terminale della fonte di terra dell'alimentatore.
Riempire il pallone Dewar con azoto liquido a circa 1 centimetro dall'alto in modo che tre quarti della pellicola siano sommersi. Quindi, impostare la pompa a siringa su una velocità di infusione di 30 millilitri all'ora e spruzzare i campioni secondo il protocollo di testo. Una volta completata l'infusione, versare con cura l'azoto liquido in eccesso dal Dewar, lasciando il microcarrier sospeso in circa 25 millilitri di azoto liquido per garantire che rimangano congelati.
Trasferire immediatamente i microcarrier con azoto liquido in una provetta da centrifuga da 50 millilitri versando con un movimento regolare. Quindi, usa una scoopula per raccogliere eventuali microportatori congelati rimasti nel Dewar. Aggiungeteli alla provetta da centrifuga. Per prepararsi alla liofilizzazione, coprire la provetta da centrifuga con un foglio di alluminio forato con piccoli fori. Mettere le provette da centrifuga coperte in un pallone liofilizzatore. Quindi, collegare immediatamente il pallone al liofilizzatore e asciugare i campioni durante la notte.