Definizione di un modello di co-coltura tridimensionale dei gangli della radice dorsale murina e delle cellule tumorali: un modello in vitro per studiare l'invasione delle cellule tumorali perineurali

L'invasione perineurale o PNI si riferisce alla migrazione delle cellule tumorali lungo i nervi e alla loro successiva invasione nel perinevrio, un microambiente adatto per la crescita e la metastasi del cancro.

Per imitare la PNI in vitro, iniziare aggiungendo una goccia di matrice extracellulare o di sospensione ECM su un piatto di coltura in modo che assuma la forma di un emisfero. Ora, incubare la piastra di coltura per rafforzare le caratteristiche strutturali e funzionali dell'impalcatura 3D.

Successivamente, posizionare con cura un ganglio della radice dorsale pre-raccolto o DRG, un gruppo di neuroni sensoriali, al centro della gocciolina semisolida della ECM. Incubare per incorporare il DRG all'interno della gocciolina ECM.

Successivamente, aggiungere un terreno di coltura adatto e incubare. L'ECM integrata con nutrienti favorisce la germinazione di DRG in piccole proiezioni nervose chiamate neuriti che crescono radialmente verso la circonferenza della gocciolina.

Rimuovere il terreno esaurito per preparare la gocciolina ECM per il test successivo. Cellule tumorali aderenti colorate in modo fluorescente del seme sopra la gocciolina. A causa della forma emisferica, le cellule tumorali si ribaltano e si depositano lungo la periferia delle goccioline.

Incubare la piastra di coltura per consentire l'interazione cellula tumorale-neurite. Se osservate al microscopio a fluorescenza, le cellule tumorali possono essere viste seguire i neuriti e migrare verso il DRG, confermando l'invasione perineurale.

Per preparare le goccioline di matrice semisolida, trasferire una piastra di vetro con fondo a pozzetto dal ghiaccio su un blocco di ghiaccio sotto il microscopio operatorio. Posizionare la punta di una pipetta da non più di 10 microlitri direttamente sul bicchiere con un angolo di 45 gradi ed erogare con cura una goccia di matrice da 1,5 microlitri sul bicchiere. Allontanare lentamente il puntale della pipetta dal vetro man mano che la matrice si innesta nella piastra.

Depositare una goccia di matrice su ciascuno dei quattro angoli della piastra e trasferire la piastra su una superficie a temperatura ambiente per circa 1 minuto. Quando la matrice si è leggermente irrigidita, rimettere la piastra nel blocco di ghiaccio e utilizzare una pinza microscopica chiusa per raccogliere delicatamente il DRG con la mano sinistra.

Usando la mano destra, trasferisci con cura il tessuto nervoso sulla punta di un ago da 21G e usa l'ago per inserire delicatamente il DRG al centro della gocciolina della matrice. Il DRG dovrebbe essere rilasciato facilmente nella matrice per il posizionamento centrale con l'ago.

Dopo aver inserito un pezzo DRG in ciascuna delle quattro goccioline, posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 3 minuti. Quando tutti i DRG sono stati incorporati, tenere le piastre una alla volta con una leggera angolazione e aggiungere lentamente 4 millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS alle piastre in modo che il fluido entri in contatto solo gradualmente con le unità DRG della matrice.

Rimetti le piastre nell'incubatrice per altre 48-72 ore. Quando i neuriti raggiungono almeno il 75% del percorso fino al bordo della matrice, aspirare il mezzo dai pozzetti senza rimuovere le unità matrice-DRG. Quindi, utilizzando una pipetta da 200 microlitri con un grilletto regolare, posizionare due gocce da 3 volte 10 a una quinta cellula per millilitro di terreno su ciascun saggio DRG della matrice e rimettere le piastre nell'incubatore. Dopo un'ora, aggiungere delicatamente 4 millilitri di DMEM con il 10% di FBS lungo la parete laterale della piastra con fondo in vetro e rimettere le piastre nell'incubatore fino alla successiva valutazione microscopica.